면역 반응과 수면에서의 양적 측정<em> Drosophila</em
Summary
면역 반응과 행동 사이의 링크를 이해하기 위해, 우리는에서 전위의 행동을 측정하는 방법을 설명<em> Drosophila</em> 세균 감염뿐만 아니라 모니터링 생존, 박테리아 부하, 그리고 타고난 면역, NFκB의 핵심 레귤레이터의 실시간 활동에 의해 면역 반응을 마운트하는 파리의 능력 중.
Abstract
면역 반응 및 호스트의 행동 사이의 복잡한 상호 작용이 종의 다양한에서 설명되었습니다. 초과 수면은 특히 포유류 1 감염에 대한 응답으로 발생하는 것으로 알려져 있으며, 최근 Drosophila melanogaster 2에 설명되어 있습니다. 그것은 일반적으로 수면 감염 동안 호스트에 유용합니다하고 강력한 면역 체계 3,4의 유지를위한 중요하다는 것을 것을 가능합니다. 그러나,이 가설을 지원하는 실험적 증거는 4 한정되어 있으며, 면역 반응시 초과 수면의 기능은 불분명 남아 있습니다. 우리는이 복잡한 문제를 해결하기 위해 종합 접근 방식을 사용했으며, 간단한 유전자 모델 시스템 fruitfly Drosophila melanogaster에서 연구를 실시하고 있습니다. 우리는 파리에서 전위의 행동과 수면을 측정하기위한 표준 분석을 사용하여,이 분석은 파리 infecte의 행동을 측정하기 위해 사용되는 방법을 보여줍니다박테리아의 병원성 변형과 D. 이 분석은 또한 감염 기간 동안 개인 파리의 생존 기간을 모니터링하는 데 유용합니다. 면역 기능의 추가 조치는 감염과 NFκB, Drosophila의 본래 면역 반응의 중심 핵심 전사 인자의 활성화를 삭제하는 파리의 능력이 포함되어 있습니다. 감염 동안 생존 결과 및 세균 통관 모두가 함께 저항 및 감염에 대한 내성의 지표입니다. 관용이 시스템 5 내 병원균 높은 수준의에도 불구하고 감염 피해를 제한함으로써 생존 할 수있는 호스트의 능력으로 정의되는 동안 저항은 감염을 취소 할 수 파리의 능력을 말합니다. 감염시 NFκB 활동의 실시간 모니터링은 감염 동안 생존의 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 간단 assays에 Drosophila의 사용은 수면의 유전 및 분자 분석을 용이하게및 면역 반응과 두 복잡한 시스템은 서로 영향을받습니다.
Protocol
이 프로토콜은 세균 감염의 대상이 파리에서 수집 한 네 가지 판독을 취득하는 두 설정 (그림 1)를 사용합니다. 2) 생존 결과; 3) 플라이에 세균로드, 그리고 4) 생체 내 NFκB의 기자 활동의 실시간 측정이 출력) 슬립 / 웨이크 동작을 하나 포함되어 있습니다. Drosophila에서 사용할 수있는 유전 도구와 함께, 이러한 측정은 면역 기능과 행동 사이의 분자 링크로 기계론의 통찰?…
Representative Results
감염은 수면을 촉진합니다. 이 예에서는 광동-S는 (CS) 야생 타입 파리와 NFκB 유전자 양념 (상대적 E20) 14이 부족한 돌연변이 파리는 두 DAM2 활동 모니터에로드 된 (N = 각 유전자형 32)와 위에서 설명한대로 감염. 파리는 행동과 감염 2,7,8에 circadian 시계의 영향을 제거하기 위해 지속적으로 빛을 유지했다. 로 이전 11 설명 상대적 E20의 돌연변이는 CS에 isogenized?…
Discussion
이 프로토콜은 문제는, 특히 잠, 면역 반응 매개 변수에 연결되는 방식을 조사 할 방법을 설명합니다. 이 매개 변수는 생체의 루시 페라 제 리포터에 의해 측정으로 세균로드, 생존 결과 및 NFκB 활동이 포함되어 있습니다. 함께 이러한 매개 변수는 파리가 감염을 싸울 수있는 방법을 잘에 대한 정보를 제공합니다. 박테리아 부하와 생존 결과는 Drosophila의 직접적인 측정을 포함 면역 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 부여 # IOS-1025627 아래에있는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 지원과 보조금에 따라 국립 보건원 # 1R21NS078582-01의 턱에 한
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
| Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
| Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5×65 | |
| Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
| Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Supplies | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G – cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
| Silicone Tubing, i.d. (0.030″) o.d. (0.065″) Wall Thickness (0.018″) | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
| 3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence – they must be opaque. |
| TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Software | |||
| Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
| Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
| Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) |
References
- Majde, J. A., Krueger, J. M. Links between the innate immune system and sleep. J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).
- Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
- Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. Parasite resistance and the adaptive significance of sleep. BMC Evol Biol. 9, 7 (2009).
- Imeri, L., Opp, M. R. How (and why) the immune system makes us sleep. Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).
- Ayres, J. S., Schneider, D. S. A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections. PLoS Biol. 6, e305 (2008).
- Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. (43), e2157 (2010).
- Lee, J. E., Edery, I. Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections. Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).
- Stone, E. F., et al. The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila. PLoS Pathog. 8, e1002445 (2012).
- Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster. Génétique. 183, 1477-1491 (2009).
- Short, S. M., Lazzaro, B. P. Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).
- Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish. Sleep. 30, 389-400 (2007).
- Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. Functional analysis of the Drosophila immune response during aging. Aging Cell. 7, 225-236 (2008).
- Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK. Science. 293, 2251-2256 (2001).
- Hedengren, M., et al. Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila. Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).
- Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).
- Wu, L. P., Choe, K. -. M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Génétique. 159, 189-199 (2001).
- Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum. Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).
- Romeo, Y., Lemaitre, B. Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways. Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).
- Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. V. The antibacterial arm of the Drosophila innate immune response requires an I{kappa}B kinase. Genes Dev. 15, 104-110 (2001).
- Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13843-13847 (2006).
- Bushey, D., Hughes, K. A., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep, aging, and lifespan in Drosophila. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
- Allee, W. C. . The social life of animals. , (1938).
- Stanewsky, R., Jamison, C. F., Plautz, J. D., Kay, S. A., Hall, J. C. Multiple circadian-regulated elements contribute to cycling period gene expression in Drosophila. Embo. J. 16, 5006-5018 (1997).
- Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. Signal analysis of behavioral and molecular cycles. BMC Neurosci. 3, 1 (2002).
- Ayres, J. S., Schneider, D. S. The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000150 (2009).
- Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila. Science. 278, 1632-1635 (1997).
- Huber, R., et al. Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster. Sleep. 27, 628-639 (2004).
- Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31, 1587-1598 (2008).
- Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice. J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).
- Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
- Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31, 465-472 (2008).
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Quantitative MeasurementImmune ResponseSleepDrosophilaInfectionExcess SleepMammalsDrosophila MelanogasterRobust Immune SystemMultidisciplinary ApproachLocomotor BehaviorPathogenic Strain Of BacteriaDuration Of SurvivalImmune FunctionNFκBTranscription FactorInnate Immune ResponseBacterial ClearanceResistance To InfectionTolerance To Infection
Citer Cet Article
Kuo, T., Handa, A., Williams, J. A. Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila. J. Vis. Exp. (70), e4355, doi:10.3791/4355 (2012).