Summary

Kwantitatieve meting van de immuunrespons en Sleep in<em> Drosophila</em

Published: December 04, 2012
doi:

Summary

Om een ​​verband tussen de immuunrespons en gedrag te begrijpen, beschrijven we een methode om locomotorisch gedrag te meten in<em> Drosophila</em> Tijdens bacteriële infectie en het vermogen van vliegen tot een immuunrespons door monitoring overleving, bacteriële belasting en real-time activiteit van een centrale regulator van aangeboren immuniteit, NFKB.

Abstract

Een complexe interactie tussen de immuunrespons en ontvangende gedrag is beschreven in diverse soorten. Overmaat slaap, in het bijzonder kan optreden als reactie op infectie bij zoogdieren 1 en is onlangs ook beschreven in Drosophila melanogaster 2. Het is algemeen aanvaard dat de slaap gunstig voor de gastheer tijdens een infectie en dat het belangrijk is voor het behoud van een robuust immuunsysteem 3,4. Echter experimenteel bewijs dat deze hypothese ondersteunt beperkt 4 en de functie van overtollige slaap tijdens een immuunreactie blijft onduidelijk. We hebben gebruik gemaakt van een multidisciplinaire aanpak van dit complexe probleem aan te pakken, en hebben studies uitgevoerd in de eenvoudige genetische modelsysteem, de fruitvlieg Drosophila melanogaster. We maken gebruik van een standaard test voor het meten van locomotorisch gedrag en slapen in vliegen, en zien hoe deze test wordt gebruikt om gedrag in vliegen infecte metend met een pathogene bacteriestam. Deze bepaling is ook nuttig om de overlevingskans in individuele vliegen tijdens een infectie. Aanvullende maatregelen van het immuunsysteem omvatten het vermogen van vliegen een infectie en de activering van NFKB een belangrijke transcriptiefactor die centraal in de aangeboren immuunrespons in Drosophila wissen. Zowel uitkomst van overleving en bacteriële klaring tijdens infectie bij elkaar zijn indicatoren van resistentie en tolerantie voor infectie. Weerstand verwijst naar het vermogen van vliegen een infectie duidelijk, terwijl tolerantie wordt gedefinieerd als het vermogen van de gastheer om schade door een infectie dan beperken en overleven ondanks hoge pathogeen in het systeem 5. Real-time monitoring van NFKP activiteit tijdens infectie geeft inzicht in een moleculair mechanisme van overleven tijdens de infectie. Het gebruik van Drosophila in deze assays maakt het eenvoudige genetische en moleculaire analyses van slaapen de immuunrespons en hoe deze twee complexe systemen samengebouwd beïnvloed.

Protocol

Dit protocol gebruikt twee opstellingen (figuur 1) te verwerven vier verschillende uitlezingen vanuit vliegen aan een bacteriële infectie. Deze uitgangen zijn 1) slaap / waak gedrag; 2) uitkomst van overleving; 3) bacteriële belasting in de vlieg, en 4) real-time meting van NFKB reporter activiteit in vivo. In combinatie met de genetische technieken die beschikbaar zijn in Drosophila, deze metingen geven inzicht in de mechanistische moleculair verband tussen het immuunsysteem en gedr…

Representative Results

Infectie bevordert de nachtrust. In dit voorbeeld, Canton-S (CS) wildtype en mutant vliegen vliegen ontbreekt een NFKB gen, Relish (Rel E20) 14 werden geladen in twee DAM2 activiteitsmonitoren (n = 32 per genotype) en geïnfecteerd zoals hierboven beschreven. Vliegen werden in constant licht de invloed van de circadiane klok gedrag en 2,7,8 infectie elimineren. De Rel E20 mutanten werden isogenized op CS zoals hiervoor beschreven 11. Beide vliegen werden geïnfectee…

Discussion

Dit protocol beschrijft een aanpak om te onderzoeken hoe het gedrag, in het bijzonder slapen, is gekoppeld aan immuunrespons parameters. Deze parameters omvatten bacteriële belasting effect op overleving en NFKB zoals die met een luciferase reporter in vivo. Samen vormen deze parameters geven informatie over hoe goed een vlieg kan een infectie te bestrijden. Bacteriën en effect op overleving zijn immuunrespons parameters is een eenvoudige meting in Drosophila betrekken. Rel E20 mu…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation onder toekenning # IOS-1025627 en door de National Institutes of Health onder subsidie ​​# 1R21NS078582-01 naar JAW

Materials

Material Name Company Catalogue number Comments
Equipment
Incubators Percival Scientific, Inc. I30BLLC8
I36VLC8
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate.
Drosophila Activitiy Monitors Trikinetics Inc., Waltham, MA DAM2 As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories.
Pyrex Glass Tubes Trikinetics Inc., Waltham, MA PGT-5×65
Microplate scintillation and luminescence counter Perkin Elmer TopCount NXT
12 detector
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates.
FluorChem 8900 Alpha Innotech Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient.
Micropipette Puller Tritech Research, Inc. Narishige PC-10
Supplies
Borosilicate Glass Capillaries World Precision Instrument Inc. 1B100F-4
3 ml Syringe Fisher Scientific BD 305482
Syringe Needles Fisher Scientific BD 305196 18 G – cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing.
Silicone Tubing, i.d. (0.030″) o.d. (0.065″) Wall Thickness (0.018″) VWR 60985-706 Used for attaching glass capillary needles to a syringe
3 Way Stopcock American Pharmaseal Company K75
Kontes Pellet Pestle Cordless Motor Fisher Scientific K749540-0000
Kontes Pellet Pestle Fisher Scientific K749521-1590
Glass balls 3mm VWR 26396-630
Microplate Microlite 1+ Thermo Scientific 7571 Select 96-well plates that are appropriate for luminescence – they must be opaque.
TopSeal-A:96-well Microplates PerkinElmer 6005185 Microplate Press-On Adhesive Sealing Film
D-Luciferin, Potassium Salt Gold BioTechnology, Inc. LUCNA
Software
Insomniac2 Available upon request to the authors custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11
Drosonex Available upon request to the authors custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system
Photoshop CS3 Adobe Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional)

References

  1. Majde, J. A., Krueger, J. M. Links between the innate immune system and sleep. J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).
  2. Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
  3. Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. Parasite resistance and the adaptive significance of sleep. BMC Evol Biol. 9, 7 (2009).
  4. Imeri, L., Opp, M. R. How (and why) the immune system makes us sleep. Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).
  5. Ayres, J. S., Schneider, D. S. A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections. PLoS Biol. 6, e305 (2008).
  6. Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. (43), e2157 (2010).
  7. Lee, J. E., Edery, I. Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections. Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).
  8. Stone, E. F., et al. The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila. PLoS Pathog. 8, e1002445 (2012).
  9. Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster. Génétique. 183, 1477-1491 (2009).
  10. Short, S. M., Lazzaro, B. P. Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).
  11. Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish. Sleep. 30, 389-400 (2007).
  12. Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. Functional analysis of the Drosophila immune response during aging. Aging Cell. 7, 225-236 (2008).
  13. Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK. Science. 293, 2251-2256 (2001).
  14. Hedengren, M., et al. Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila. Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).
  15. Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection. EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).
  16. Wu, L. P., Choe, K. -. M., Lu, Y., Anderson, K. V. Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection. Génétique. 159, 189-199 (2001).
  17. Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum. Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).
  18. Romeo, Y., Lemaitre, B. Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways. Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).
  19. Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. V. The antibacterial arm of the Drosophila innate immune response requires an I{kappa}B kinase. Genes Dev. 15, 104-110 (2001).
  20. Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13843-13847 (2006).
  21. Bushey, D., Hughes, K. A., Tononi, G., Cirelli, C. Sleep, aging, and lifespan in Drosophila. BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).
  22. Allee, W. C. . The social life of animals. , (1938).
  23. Stanewsky, R., Jamison, C. F., Plautz, J. D., Kay, S. A., Hall, J. C. Multiple circadian-regulated elements contribute to cycling period gene expression in Drosophila. Embo. J. 16, 5006-5018 (1997).
  24. Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. Signal analysis of behavioral and molecular cycles. BMC Neurosci. 3, 1 (2002).
  25. Ayres, J. S., Schneider, D. S. The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila. PLoS Biol. 7, e1000150 (2009).
  26. Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila. Science. 278, 1632-1635 (1997).
  27. Huber, R., et al. Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster. Sleep. 27, 628-639 (2004).
  28. Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. A video method to study Drosophila sleep. Sleep. 31, 1587-1598 (2008).
  29. Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice. J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).
  30. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25, 129-138 (2000).
  31. Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31, 465-472 (2008).

Play Video

Citer Cet Article
Kuo, T., Handa, A., Williams, J. A. Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila. J. Vis. Exp. (70), e4355, doi:10.3791/4355 (2012).

View Video