يجب إجراء دراسة خلايا الكبد البطانية الجيبية (ثانية) مع الخلايا الأولية التي تم الحصول عليها من الحيوان كما لا توجد خطوط الخلايا. هذا الأسلوب يعتمد على الهضم والكبد الطرد المركزي المغاير لتنقية ثانية لزراعة اللاحقة والتجريب.
الكبد هو مركز الأيضية للجسم الثدييات وبمثابة تصفية الدم. ويتضح في البنية الأساسية للكبد في الشكل (1) الذي يتكون أكثر من 85 ٪ من كتلة الكبد من خلايا الكبد ، وتتكون النسبة المتبقية البالغة 15 ٪ من الكتلة الخلوية لخلايا كوبفر (KCS) ، والخلايا النجمية (HSCs) ، و الخلايا البطانية الجيبية (ثانية). SECS تشكل جدران الأوعية الدموية داخل الكبد وتحتوي على التشكل داخل متخصصة تسمى نافذي في السيتوبلازم. نوفذة من السيتوبلازم هو مظهر من الثقوب (~ 100 ميكرون) داخل الخلايا بحيث الفعل SECS بمثابة غربال فيه معظم كيلومكرونات ، وبقايا الكيلومكرونات والجزيئات ، ولكن ليس الخلايا ، بالمرور إلى خلايا الكبد وHSCs 1 (الشكل 1). نظرا لعدم وجود الغشاء القاعدي ، والفجوة بين SECS وتشكيل خلايا الكبد من Disse الفضاء. HSCs تشغل هذه المساحة وتلعب دورا بارزا في التنظيم وردا على طnjury ، وتخزين حمض الريتينويك ومناعي لل2 الكبد.
SECS هي من بين الأكثر نشاطا endocytically خلايا الجسم تعرض فيها مجموعة من المستقبلات زبال في كل خلية 3 السطح. وتشمل هذه SR – A ، وStabilin 1 – 2 – Stabilin. عموما ، يتم أخذ الجسيمات الغروية صغيرة أقل من 230 نانومتر ، والجزيئات في المرحلة العازلة بنسبة SECS ، بينما هو endocytosed الجزيئات الكبيرة والحطام الخلوية (phagocytosed) بواسطة KCS 4. وبالتالي ، فإن إزالة القسم الأكبر من المواد خارج الخلية مثل الجليكوزامينوجليكان من الدم يعتمد بشكل كبير على صحة وظائف التقامي SECS من 5،6. على سبيل المثال ، زيادة في مستويات hyaluronan الدم يدل على مرض الكبد تتراوح ما بين خفيفة إلى أشكال أكثر خطورة 7.
باستثناء تقرير واحد 8 ، لا توجد خطوط الخلية SEC خلدت في الوجود. حتى هذا الخط هو خلد الخلية دي التفاضليةated في أنه لا يعبر عن مستقبلات زبال التي موجودة على SECS الابتدائية (البيانات المتوفرة لدينا ، لا يظهر). يجب إجراء جميع الدراسات الخلية البيولوجية على الخلايا الأولية التي تم الحصول عليها حديثا من الحيوان. للأسف ، في ظل ظروف SECS dedifferentiate ثقافة موحدة ويجب أن تستخدم في غضون أيام 1 أو 2 على بمعزل عن الحيوان. ويتميز تمايز SECS عن طريق التعبير عن Stabilin – 2 أو مستقبلات هير 9 ، CD31 ، ووجود نوفذة حشوية 1. ويمكن تمديد تمايز SECS بإضافة عامل نمو بطانة الاوعية في وسائل الإعلام أو الثقافة أو عن طريق زرع الخلايا الكبدية في المتوسط 10،11 مكيفة.
في هذا التقرير ، سوف ندلل من النشاط التقامي SECS في الجهاز سليمة باستخدام الراديو المسمى الهيبارين لhyaluronan لمستقبلات Stabilin SEC – 2 – محددة. ثم سنقوم تنقية الكبد وSECS من الكبد perfused لقياس الإلتقام.
التخدير من الفئران من خلال طريقة قطرة شنقا في اللاوعي التي isoflurane يدفع البخار هو الأسلوب المفضل لدراستنا. ويمكن أيضا أن تستخدم المرذاذ بدلا من الحقنة مع القطن للحفاظ على الحيوانات خارج الغرفة ، ولكن العمليات الجراحية يتم ذلك بسرعة ، ليست مطلوبة. إضافة إلى البولي ايثيلين جلايكول isoflurane لخفض ضغط البخار ومعدل التبخر. كثيرا جدا سوف بخار isoflurane لحث الموت بسرعة كبيرة جدا. إذا مات الحيوان قبل مقنى الكبد ومتبيض مع TBS ، وتجميع تجلط الدم قد في الكبد ومنع غسل الفعال للsinusoids والهضم مع كولاجيناز. بالإضافة إلى ذلك قد يكون من المفيد الهيبارين كمضاد للتخثر ولكنه لا يستخدم في هذه الدراسات منذ نستخدم الهيبارين وصفت بأنها التحقيق لدينا.
غالبا ما يتم استبدال حل Gey مخزنة في المياه المالحة (GBSS) من قبل مختبرات أخرى لتنقية ثانية. في حين أنه مفيد لتنقية المجلس الأعلى للتعليم ، التهاب الكبدatocytes لا تتسامح مع GBSS فضلا عن المخازن 1-3 و viabilities لا يصل تقريبا. عند قياس الإلتقام ، فمن الممارسة السليمة لقياس مستويات الخلفية في الجهاز وتنقيته في خلايا الكبد.
هذا الأسلوب هو واحد من اثنين لتنقية كفاءة SECS بعد نضح الكبد مع كولاجيناز. الأسلوب الآخر يفصل الخلايا غير متني بواسطة الطرد المركزي تصويل 19 بدلا من التدرج Percoll. مزايا لاستخدام أكثر من التدرجات تصويل Percoll viabilities هي الخلية أعلى قليلا والأرقام. الجانب السلبي هو أن الطرد المركزي تصويل يتطلب الدوار المتخصصة ، وأجهزة الطرد المركزي المخصصة ، ومضخة تمعجية معا والتي تكلف عشرات الآلاف من الدولارات. هذا الأسلوب يتطلب سوى استخدام جهاز طرد مركزي طاولة المبردة ومضخة تمعجية الذي هو المعيار في مختبرات عديدة.
فصل SECS وKCS بواسطة التصاق الانتقائي هو أسلوب قياسي20-22. ولئن كان صحيحا أن SECS ستلتزم الزجاج والبلاستيك ، والنقطة الرئيسية هي استخدام حمض غسل الزجاج نظيفة مع عدم وجود أكثر من 15 دقيقة الحضانة عند 37 درجة مئوية في 5 ٪ CO 2. KCS سوف تلتزم دائما أسرع من SECS ويستحسن أن يغسل بلطف KCS مع وسائل الإعلام لاستخراج أي SECS المتبقية التي أصبحت فضفاضة يعلق. كما يتم حذف Pronase البروتياز وغيرها من الخطوات الهضم كولاجيناز في هذا البروتوكول لزيادة viabilities الخلايا. البروتياز هضم مستقبلات خارج الخلية ، وربما تحول دون التصاق الخلوية في الخطوات تنقية النهائي.
الطريقة المعروضة هنا لديها تشكيلة واسعة من التطبيقات. على الرغم من أننا تظهر النتيجة النهائية التي اتخذت في البداية للحصول على الهيبارين التروية ، وإزالة الكبد للحصول على خلايا الكبد الأولية ، قد KC ، SECS ، وHSCs يكون مفيدا لعدد من الدراسات التي تنطوي على المسارات الأيضية ، مناعي ، والأنشطة زبال ، وغيرها الفسيولوجية ستوديوفاق. أصعب جزء من هذا الإجراء هو جيد إقناء ؛ إدخال القنية ، والهضم للكبد ، والتعامل مع الكبد دون الحاجة لقسطرة زلة من الوريد البابي.
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر الدكتور بول يغل في جامعة. أوكلاهوما لاستخدام ريتوكسيماب 30 لاكتشاف مستقبلات HARE/Stabilin-2 ويجل جانيت للحصول على المساعدة التقنية لها. ويتم تمويل هذا البحث من جامعة نبراسكا لصناديق البحوث.
All salts are from Sigma-Aldrich
Name | Company | Model/catalog # | Comment |
20L water bath | ThermoFisher | 2231 | Water is about 45°C to compensate for cooling within the tubing. |
Peristaltic Pump | Cole-Parmer | 7553-70 | Masterflex series |
Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend XTR | |
Catheter | BD Biosciences | 381444 | |
Dessicator chamber | Fisher | 08595E | Use internal plate |
Percoll | Sigma | P4937 | |
Bovine Serum Albumin | SeraCare | AP-4510-01 | |
100 μm mesh | Spectrum labs | 146488 | |
30 μm mesh | Spectrum labs | 146506 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
Polyethylene glycol | Spectrum labs | PO107 |