In vivo Leber Endozytose durch Reinigung von Leberzellen durch Leberperfusion Gefolgt

1. Excision der Leber (übernommen von PO Seglen 12 und R. Blomhoff 13 mit Modifikationen 14,15) Fügen Sie 10 ml 30% Isofluran in Polyethylenglykol in eine Petrischale in einem geschlossenen 5,5 L Kammer. Es ist optimal, 10-15 min nach der Zugabe von Isofluran auf eine stabilisierte Luft innerhalb der Kabine zu schaffen warten. Legen Sie eine Ratte in der verschlossenen Kammer und lassen Sie es sich betäubt. Volle Auswirkungen der Narkose sind offensichtlich, wenn das Tier wird schlaff, reagiert und weist tiefe Atmung. Platz 2 mL von Isofluran in Polyethylenglykol in einigen Wattebällchen auf den Boden einer 30 ml Spritze Rohr. Legen Sie die Ratte auf dem Rücken auf einer Windel bedeckt, und bewahren Sie die Spritze Rohr über die Schnauze. Unmittelbar bestätigen tiefe Narkose durch Benetzung des Bauches mit 70% Ethanol. Lassen Sie sich nicht das Tier von Isofluran Überdosis sterben. Mit Bandage Scheren und Zangen, setzen die gesamte abdominal Hohlraum. Suchen Sie die Pfortader und mit einer Pinzette ziehen zwei Stränge der chirurgischen Seide oder Polyester Faden (Ligatur) unter der Pfortader unmittelbar oberhalb der mesenterialen Branche. Ziehen Sie die Zange und Krawatte ein loses Überhandknoten. Mit einer Pinzette unter die Pfortader und vorsichtig wieder zu begradigen die Vene, kanülieren die Vene mit einer Insyte Autoguard Katheter (18 GA, 1,3 x 300 mm, BD Biosciences) oder ähnliche Katheter. Der Katheter sollte einige mm über der Schleife durch das Gewinde geformt gehen. Einfahren und entfernen Sie die Nadel durch die Freigabe der federbelastete Trigger auf dem Katheter. Blut sollte beginnen sickern bis in den Katheter der Angabe der richtigen Ligatur Platzierung. Ziehen Sie die Überhandknoten und sichern Sie es mit einem anderen Überhandknoten. Sever entweder die untere Hohlvene oder absteigenden Aorta (Aorta abdominalis), damit Blut aus dem Kreislaufsystem abtropfen lassen. Begin Spülung der Leber mit sauerstoffreichemTBS bei 37 ° C, um das Blut (Blanchieren) bei einer Flussrate von 20 ml / min zu entfernen. Die Leber sollte von einem rötlich-violett zu einem Lehm verfärben. Während die Leber Spülung, Verbrauchssteuern der Leber durch das Wegschneiden des GI-Trakts und des Bindegewebes. Es ist wichtig, nicht auf die Leber oder Punktion der Glisson'sche Kapsel zerreißen. Legen Sie die Leber auf einem Kunststoff-Netz über einen Trichter, Puffern gesammelt und rückgeführt werden können. Puffer an dieser Stelle sollte nicht zurückgeführt werden, sondern fließen in den Abfall Becher. Die Spülung sollte nicht länger als 10 min. (Abb. 2A). Bereiten Sie die Endozytose Lösung in Schritt 2.1 erforderlich. 2. Die Internalisierung von 125 I-SA-b-Hep (oder einem anderen geeigneten markierten Liganden) Um 50 mL RPMI-Medium in einem kleinen Becherglas, bis zu einer Endkonzentration 0,05% BSA und 0,01 mCi 125 I-SA-b-Hep oder anderen entsprechend markierten Liganden für Endozytose hinzuzufügen. Bringen Sie diesen Becher auf die Apparatus für Sauerstoffzufuhr zu ermöglichen. Schalten Sie die Pumpe, schalten Sie den Zulaufschlauch und dann an der Pumpe drehen bei 20 mL / min. Wie die Bezeichnung RPMI Ansätze der Leber, schalten Sie die Pumpe und lassen überschüssige Flüssigkeit in den Trichter und Schlauch abtropfen lassen. Setzen Sie den Ablaufschlauch in die Medien Becherglas Rückführung von markierten Medien ermöglichen und starten Sie dann die Pumpe. Lassen Flüssigkeiten durch die Leber nicht mehr als 1 Stunde umwälzen. Während dieser Verinnerlichung Schritt sicher, dass die Temperatur in der Leber ist stabil durch Abdecken und bereiten die Kollagenase für die Verdauung. 3. Die Verdauung der Leber durch Kollagenaseverdau Frisch gelöst und filtriert (0,45 um) Kollagenase (100 mg / kg Ratte Gewicht) sollte hinzugefügt werden, um 2 in einem Gesamtvolumen von nicht zu 60 mL bei 37 ° C übersteigen Buffer werden Die Lautstärke ist abhängig von der Länge / Innenvolumen des Rohrs und sollte entsprechend angepasst werden. Stoppen Sie die Pumpe und den Austausch derZulaufschlauch aus der Medien-Becher auf die TBS. Flush in der Leber für 2 min bei 50 mL / min, die zum Lösen der desmosomalen Zellkontakte, die Calcium-abhängig sind erlaubt. Während die Leber Spülung, den Austausch der Medien Becherglas mit der Becher mit Kollagenase auf das Gerät. Unmittelbar nach dem Spülen, beginnen die Verdauung mit Kollagenase in einem Kreislauf Schleife bei einer Flussrate von 20 ml / min für bis zu 15 min. Da Kollagenase Chargen von Lot-Nummer ändern, müssen Schwankungen in der Menge und der Zeit der Verdauung, für jede neue Charge von Kollagenase optimiert werden. Collagenase ist auch Calcium-abhängig. Schalten Sie die Pumpe und die Schalter der Puffer-und Gasleitungen von Flask A bis Flask B. Übertragung des Abwassers Linie von den Abfallbehälter zu Flask B (Abb. 2B). Stoppen Sie die Pumpe, entfernen Sie den Katheter und den Transfer der Leber zu einer Schale mit 20-30 mL Puffer 1. Ziehen Sie die Glisson'sche Kapsel der Leber und schütteln Sie die Zelles in der Flüssigkeit. Da die Flüssigkeit trübt sich mit zellulären Material, übertragen Sie die Zellen durch ein 100 um Sieb durch Filtration durch ein 30 um Maschenweite und dann in eine 50 ml konischen auf Eis. Fügen Sie weitere Puffer 1 für die Leber und weiter Schütteln Zellen aus der Leber-Matrix, die Übertragung der Flüssigkeit auf die Siebe und konisch. Wiederholen Sie die Schritte von 3,7 bis 3,9, bis keine Zellen mehr mit vertretbarem Schütteln der Leber verdrängt werden. 4. Hepatozyten und SEC Reinigung Zentrifugieren Sie die 50 ml konische enthaltenden Zellen bei 150 xg für 3 min. Zum Pelletieren der Hepatozyten. Die Flüssigkeit enthaltende Fraktion nicht Parenchymzellen an die frische 50 ml konische auf Eis. Waschen Sie den Hepatozyten werden Resuspendieren des Pellets in Puffer 3 und wiederholen Sie die Schritte 4.1 und 4.2 noch dreimal. Am Ende des wäscht, werden die Pellets ≥ 97% reinem Hepatozyten. Um die SECS, Zentrifuge alle Rohre containing gebündelt Überstand (enthält Blutstammzellen, SECS, und KCS und einige kleine Hepatozyten) bei 200 xg für 10 min. bei 4 ° C. Saugen Sie den Puffer und resuspendieren alle Pellets in 5 ml RPMI / BSA bei 4 ° C. Pool der Zellen zusammen in 2 Röhren und fügen RPMI / BSA bis zu einem Volumen von 35 mL. Zentrifugieren Sie die konische bei 100 xg für 3 min. Sammeln Sie die Top 25 ml Flüssigkeit aufnehmen und in sauberen 50 ml konischen. Das Pellet in den restlichen 10 mL Medien und fügen Sie wieder 25 ml kaltem RPMI / BSA und Zentrifuge bei 100 xg für 3 min. Wiederholen Sie die Schritte 3.8 und 3.9 noch einmal, verwerfen das Zellpellet und unteren 10 mL Medien. Zentrifugieren Sie die Überstände an Pellet SECS, KCS, und HSCs bei 200 xg für 10 min. bei 4 ° C. Bereiten Sie drei 50-ml-Röhrchen mit 20 ml 25% Percoll in PBS auf Eis. Unterlage mit 15 mL 50% Percoll in jeder Röhre. Resuspendieren der Zellpellets in einem Gesamtvolumen von 30 mL RPMI / BSA. Sorgfältig Overlay each Steigung mit 10 ml Zellen und Zentrifuge bei 900 xg für 20 min bei 4 ° C. SECs und KCS haben sehr enge Auftrieb Dichten und sind an der 25/50%-Schnittstelle. HSK sind in der Regel bei 25% / media aufgrund ihrer höheren Auftrieb als Lipid speichernden Zellen-Schnittstelle. Alle verbleibenden Hepatozyten und Blutzellen der unteren Auftriebskräfte und pelletiert. Absaugen von oben nach unten in der Nähe der 25/50%-Schnittstelle und entsorgen Sie dieses Materials. Sammeln Sie die Zellen in der 25/50%-Schnittstelle und den Transfer zu einem neuen konischen mit kaltem RPMI. Das endgültige Volumen sollte ca. 40 ml zu verdünnen die Percoll werden. Centrifuge den konischen bei 350 xg für 10 min bei 4 ° C die Zellen zu pelletieren. Resuspendieren der Zellen in ~ 10 mL vorgewärmtes RPMI mit 100 U / mL Penicillin/100 g / ml Streptomycin und Platz Zellen in einer Säure-gewaschene Glas Petrischale oder Kristallisierschale. Inkubieren Sie die Zellen für 15 min. bei 37 ° C in einem Gewebekultur-Inkubator. Rock oder schwenken Sie die Platte ein wenigund dann sammeln die SECs im Überstand. Die KCS auf das Glas viel schneller als SECs halten. Alternativ können SECs aus KCS durch immunopurification mit anti-CD31 oder anti-Stabilin2/HARE Antikörpern, konjugiert an magnetische Kügelchen getrennt werden. Die Lebensfähigkeit und Zellzahl kann durch Trypanblau-Ausschluss mit einem Hämazytometer oder mit einem automatisierten Zelle Zähler beurteilt werden. Kultur der SECs auf Fibronektin-beschichteten Plastikschalen bei 37 ° C, 5% CO 2, RPMI/0.25% BSA mit 40 ng / mL VEGF, 100 U / ml Penicillin, 100 ug / ml Streptomycin oder mit Hepatozyten-konditionierten Medien. Hepatozyten, KCS, und SECs kann für die Internalisierung des markierten Materials beurteilen durch die Verwendung eines Gamma-Counter und Normalisierung zu gesamten zellulären Proteins oder durch Mikroskopie (wenn fluoreszenzmarkierten) mit diesen Kultivierungsverfahren. 5. Repräsentative Ergebnisse: Hepatocyte Reinigung ist ≥ 97% und SEC Reinigung TypikVerbündeter ≥ 95% mit dieser Methode. Excision der Bauchhöhle, Kanülierung der Pfortader und Blanchieren der Leber alle sollten innerhalb einer Minute für die besten Ergebnisse auftreten. HARE/Stabilin-2 ist ein spezifischer Rezeptor auf Leber SECs und nicht in andere Leber Zelltypen exprimiert. In diesem Beispiel wurden Zelllysate beider Hepatozyten und SECs um 5% SDS-PAGE getrennt und sondiert mit einem monoklonalen Antikörper gegen beide Isoformen von Stabilin-2 (Abb. 3). Unfraktioniertem Heparin in die Blutbahn injiziert wird von der Leber 16 gelöscht. Die Clearance ist in erster Linie von der Leber SECs im Gegensatz zu Hepatozyten und KC 17 durchgeführt. Die Stabilin-2/HARE Rezeptor ist die wichtigste Spiel-Rezeptor bindet und internalisiert in SECs 18 Heparin. In unserem Beispiel hier, beschriftet wir Heparin mit einer Biotin-Tag auf der Carboxylatgruppe von GlcNAc / NS. Die Biotin konjugiert mit jodhaltigen Streptavidin zum Nachweis von Heparin verinnerlicht proteoglycan. Injektion des markierten Heparin gefolgt von Ausbluten 30 Minuten nach der Injektion ermöglicht es uns, zu überwachen, welche Organe diese Form von Heparin zu verinnerlichen. In dieser kurzen Zeitspanne ist die Leber das primäre Organ-Clearance (Abb. 4). Um besser zu verstehen, welcher Zelltyp verantwortlich für die Freigabe ist, haben wir 125 I-SA-b-Hep zu RPMI-Medium mit 0,05% BSA ergänzt und erlaubt es durch die Leber für 20 min zirkulieren. Nach Kollagenaseverdau und zellulären Reinigung wird die überwiegende Mehrheit der markierten Heparin durch SECs im Gegensatz zu Hepatozyten (Abb. 5) verinnerlicht. Abbildung 1. Grundlegende Leber-Architektur. SECs bilden die Wände der Sinusoide und sind in der Regel gefenstert (kleine Cluster von Kreisen). Sternzellen (HSC) sind im Raum der Disse im Gegensatz zu Kupffer c gefundenEllen (KCS), die normalerweise in der Mikrovaskulatur der Sinusoide vorhanden sind. Hepatozyten besetzen die andere Seite des Raums der Disse. Abbildung 2. Schematische Darstellung des Perfusionsapparatur. A) Set-up des Geräts während der Spülung / Waschen der Sinusoide der Leber. TBS ist in einer 1 L Flasche. B) Ein 125 ml Kolben mit ~ 60 ml Puffer 2 mit Kollagenase ist für die Verdauung der Leber in einem geschlossenen Kreislauf verwendet. Das Abwasser Leitung ist auch aus dem Abfallbehälter zu Kolben B durch eine Kerbe in den Gummistopfen geändert. Der Sauerstoff-Leitung ist nicht in den Puffer mit Kollagenase (Kolben B) Schaumbildung zu vermeiden untergetaucht. Die Anschläge auf jeder Flasche sind eingekerbt, um eine effiziente Übertragung der Abwasser Linie zu ermöglichen und zu einem erhöhten Druck aus dem Sauerstoff zu verhindern. Abbildung 3. </strong> Hepatocyte Präparate sind nicht mit SECs kontaminiert. Gleiche Mengen von Zelllysaten aus gereinigten Chargen von Hepatozyten (Spur 1) und Sekunden (Spur 2) wurden um 5% SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrocellulose geblottet. Monoklonale Antikörper # 30, das spezifisch gegen beide Isoformen (315 kDa und 190 kDa) von HARE/Stabilin-2 wurde verwendet, um die Lysate Sonde. Abbildung 4. Vertrieb von markiertem Heparin in Organen. Die Ratten wurden über die laterale Schwanzvene mit 125 I-SA-b-hep warten Sie 30 Minuten injiziert und dann verblutet. Das Blut wurde aufgefangen, so dass nicht alle Organe künstlich hoch Lesungen geben. Counts pro Minute (CPM) von jedem Organ gegen das Gewicht der Orgel in g normalisiert. Abbildung 5. Menge an markiertem Heparin in Hepatozyten und Sekunden. RPMIch Medien mit 125 I-SA-b-Hep durfte durch eine intakte Leber für 20 min durch Kollagenaseverdau und zellulären Reinigung gefolgt zirkulieren. Gleiche Mengen von Hepatozyten und SEC Zellproteins Lysate wurden mit dem Bradford-Assay quantifiziert und zählte mit einem Gamma-Counter. Abbildung 6. Kupffer-Zellen werden aus SECs durch Adhäsion auf Glas getrennt. Die Zellen wurden in einer Säure-gewaschene Glas Kristallisierschale gegeben und man ließ sie für 15 min bei 37 ° C einzuhalten, 5% CO 2. Der Überstand mit nicht eingehalten Zellen wurde sanft geschwenkt und in ein Zentrifugenröhrchen. Lysate von beiden eingehalten Zellen auf Glas (Spur 1) und aus nicht-anhaftenden Zellen (Spur 2) wurden von 8% SDS-PAGE aufgetrennt, geblottet und sondiert mit einem Antikörper gegen CD163, die spezifisch für den Kupffer-Zellen ist. Abbildung 7. SECs auf Fibronektin beschichteten Kunststoff verchromt 6-Well-Schalen wurden über Nacht in RPMI inkubiert ergänzt mit 0,1% BSA. Phasenkontrast-Bilder wurden bei (A) 100x und (B) 200x Vergrößerung.