Hayvan alınan hücre hatları var gibi birincil hücreleri ile karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (sn) çalışma yapılmalıdır. Bu yöntem, karaciğer sindirim ve diferansiyel santrifüj sonraki kültür ve deney için SEC arıtma dayanmaktadır.
Karaciğer memeli vücudun metabolik merkezi ve kan için bir filtre olarak hizmet vermektedir. Karaciğer temel mimarisi hepatositlerin karaciğer kütlesinin% 85 den daha fazla oluşur ve hücresel kitle kalan% 15 Kupffer hücreleri (KCS), stellat hücreleri (HKH'lerin) oluşur Şekil 1'de gösterildiği gibi, ve sinüzoidal endotel hücreleri (sn). Sn karaciğer içinde kan damarı duvarlarının formu ve sitoplazmaya içinde Fenestra denilen özel morfolojisi içeren. Sitoplazmaya fenestrasyon saniye hareket, bir elek gibi en şilomikronlar, şilomikron kalıntıları ve makromoleküllerin, ama hücreleri, hepatositler ve HKH'lerin 1 (Şekil üzerinden geçtiği, böylece hücrelerin içinde delik görünüm (~ 100 mikron ) 1). Bazal membran olmaması nedeniyle SAN ve hepatositler arasında boşluk Disse Uzay oluşturur. HKH'lerin yer kaplamaz ve düzenleme ve ben önemli bir rol oynayabilirnjury, retinoik asit ve karaciğer 2 immunoregulation depolama.
SAN, hücre yüzeyinde 3 çöpçü reseptörleri bir dizi görüntüleme vücudun en endocytically aktif hücreleri arasında yer almaktadır . Bu SR-A, Stabilin-1 ve Stabilin-2 içerir. Genellikle, büyük partiküller ve hücresel enkaz KCS 4 (fagosite) endocytosed, oysa tampon aşamasında küçük kolloidal parçacıkları az 230 nm ve makromoleküllerin saniye tarafından alınır. Böylece, toplu boşluk gibi kan glikozaminoglikanlar gibi hücre dışı malzeme, sağlık ve 5,6 saniye endositik fonksiyonları büyük ölçüde bağlıdır. Örneğin, kan hyaluronan düzeylerinde artış, hafif ya da daha şiddetli formları 7 arasında değişen karaciğer hastalığının göstergesidir .
Bir rapor 8 istisna ile, varlığını hiçbir ölümsüzleştirdi SEC hücre hatları vardır. Hatta bu ölümsüzleştirdi hücre hattı de-diferansiyebirincil SAN (veri, gösterilmemiştir) çöpçü reseptörleri ifade etmediğini ilişkilidir. Tüm hücre biyolojik çalışmalar, taze hayvandan elde edilen birincil hücreleri üzerinde yapılmalıdır. Ne yazık ki, SAN, standart kültür koşulları altında dediferansiye ve hayvan izolasyon üzerine 1 veya 2 gün içinde kullanılması gerekir. Saniye farklılaşma Stabilin-2 veya HARE reseptör 9, CD31 ve sitoplazmik fenestrasyon 1 varlığı ifade ile işaretlenir. Saniye farklılaşma kültür ortamı VEGF ek veya hepatosit klimalı orta 10,11 kültür hücreleri tarafından uzatılabilir.
Bu raporda, SEC özel Stabilin-2 reseptör hyaluronan için radyo-etiketli heparin kullanarak sağlam organ sn endositik aktiviteleri gösterecektir. Daha sonra endositoz ölçmek için perfüze karaciğer hepatosit ve SAN arındırmak.
Anestezi, izofluran buharı neden olur bilinçsizlik çalışmalar için tercih edilen bir yöntem olduğu asılı damla yöntemi ile sıçan. Buharlaştırıcı da odasının dışında hayvanın korumak için pamuk ile bir şırınga yerine kullanılan, ancak cerrahi işlemler bu gerekli değildir, çok hızlı olabilir. Polietilen glikol, buhar basıncı ve buharlaşma oranı azaltmak için izofluran eklenir. Çok fazla izofluran buharı çok hızlı bir şekilde ölüme neden olacaktır. Kanüle karaciğer ve TBS, karaciğer havuzu kan olabilir pıhtı ile beyazlatılmış ve kollajenazlarla sinüzoidler ve sindirim verimli çamaşır önlemek önce hayvan ölür. Bir antikoagülan olarak heparin eklenmesi yararlı olabilir ancak bizim prob olarak etiketlenmiş heparin kullanan beri bu çalışmalarda kullanılmaz.
Gey tamponlu salin solüsyonu (GBSS) sık sık diğer laboratuvarlar tarafından saniye arıtma değiştirilir. SEC arıtma, hep yararlı olmakla birlikteatocytes 1-3 GBSS yanı sıra Tamponlar tahammül edemez ve canlılığı yaklaşık olarak yüksek değildir. Endositoz ölçerken, organ ve hepatositler saflaştırılmış arka plan düzeylerini ölçmek için iyi bir uygulamadır.
Bu yöntem iki biridir kollajenaz ile karaciğer perfüzyon aşağıdaki sn verimli arıtma. Diğer yöntem Yıkayarak tasviye santrifüj 19 yerine Percoll degrade olmayan parankimal hücreleri ayırır. Percoll gradyanlar üzerinde Yıkayarak tasviye kullanmak için avantajları biraz daha yüksek hücre canlılığı ve numaraları. Dezavantajı Yıkayarak tasviye santrifüj özel bir rotor, adanmış santrifüj, ve on binlerce dolar maliyeti birlikte peristaltik pompa gerektirir. Bu yöntem, yalnızca birçok laboratuvarda standart bir buzdolabında masa üstü santrifüj ve peristaltik pompa kullanımını gerektirir.
SAN ve seçici yapışma KCS ayrılması standart bir yöntem20-22. Saniye cam ve plastik uygun olacağı doğru olmakla beraber, 37, 15 dakikalık bir inkübasyon daha fazla asitle yıkanmış temiz bir cam kullanmak için kilit nokta ° C,% 5 CO 2. KCS saniye daha hızlı uyacaktır ve bu gevşek bağlı hale gelmiştir kalan sn ayıklamak için medya ile KCS hafifçe yıkamak için tavsiye edilir. Pronase ve diğer proteazlar hücrelerinin canlılığı artırmak için bu protokolü kollajenaz sindirim adımları da atlanmıştır. Proteazlar ekstrasellüler reseptörleri sindirmek ve nihai arıtma adımları hücresel adezyon inhibe edebilir.
Burada sunulan yöntem, uygulamalar geniş bir yelpazede. Heparin başlangıçta birincil hepatositler almak için karaciğerin temizlenmesi, perfüzyon için alındığı sonuçta gösterse de, KC, SAN ve HKH'lerin metabolik yollar, immunoregulation, çöpçü faaliyetleri, ve diğer ilgili çok sayıda çalışma için yararlı olabilir fizyolojik Studies. Bu prosedürün en zor kısmı, portal ven kateter kayma kalmadan iyi kanülasyonu, sindirim, karaciğer ve karaciğer taşıma.
The authors have nothing to disclose.
Biz Üniversitesi Dr Paul Weigel teşekkür etmek istiyorum. Oklahoma kullanmak için onun teknik yardım için HARE/Stabilin-2 reseptör ve Janet Weigel tespiti için monoklonal antikor 30. Bu araştırma, Nebraska Araştırma Fonları Üniversitesi tarafından finanse edilmektedir.
All salts are from Sigma-Aldrich
Name | Company | Model/catalog # | Comment |
20L water bath | ThermoFisher | 2231 | Water is about 45°C to compensate for cooling within the tubing. |
Peristaltic Pump | Cole-Parmer | 7553-70 | Masterflex series |
Refrigerated Centrifuge | Sorvall | Legend XTR | |
Catheter | BD Biosciences | 381444 | |
Dessicator chamber | Fisher | 08595E | Use internal plate |
Percoll | Sigma | P4937 | |
Bovine Serum Albumin | SeraCare | AP-4510-01 | |
100 μm mesh | Spectrum labs | 146488 | |
30 μm mesh | Spectrum labs | 146506 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 21870 | |
Polyethylene glycol | Spectrum labs | PO107 |