Summary

Развитие сотового типа конкретных анти-ВИЧ gp120 аптамеры для доставки миРНК

Published: June 23, 2011
doi:

Summary

Несколько 2'-фтор РНК аптамеры против ВИЧ-1BA-L gp120 с наномоля близость изолированы от библиотеки РНК<em> В пробирке</em> SELEX процедуры. Новый двойной тормозной функции анти-gp120 аптамер-миРНК химера создается и показывает значительные предпосылки для системных анти-ВИЧ-терапии.

Abstract

Глобальная эпидемия ВИЧ-инфекции создало насущную необходимость новых классов антиретровирусных препаратов. Мощные способности малых интерферирующих (SI) РНК для подавления экспрессии дополнительных транскриптов РНК в настоящее время используются в качестве нового класса терапевтических средств для целого ряда заболеваний, включая ВИЧ. Многие предыдущие отчеты показали, что роман RNAi основе Анти-ВИЧ/СПИД терапевтических стратегий широкие перспективы, однако основным препятствием для успешного терапевтического применения и клинических перевод siRNAs является эффективной доставки. Особенно, принимая во внимание безопасность и эффективность RNAi основе терапии, крайне желательно разработать целевые внутриклеточной доставки миРНК подход к конкретной популяции клеток или тканей. ВИЧ-1 gp120 протеин, гликопротеин конверт на поверхности ВИЧ-1, играет важную роль в вирусные вступления в клетки CD4. Взаимодействие gp120 и CD4, который вызывает ВИЧ-1, вход и инициирует слияние клеток была подтверждена как клинически значимые антивирусной стратегии для открытия новых лекарств.

При этом, во-первых, мы обсудим выбор и идентификация 2'-F изменение анти-ВИЧ gp120 аптамеров РНК. Использование обычных нитроцеллюлозных фильтров метод SELEX, несколько новых аптамеры с наномолярных близости были выделены из 50 случайных п РНК библиотеку. Для того чтобы успешно получить вид связан с более высоким сродством, выбор жесткости тщательно контролируется путем изменения условий. Выбранных аптамеры могут специфически связываться и быстро внутренним в клетках, экспрессирующих ВИЧ-1 конверт белка. Кроме того, аптамеры только могут нейтрализовать ВИЧ-1 инфекционности. Основываясь на лучших аптамер-1, мы также создаем новый двойной тормозной функции анти-gp120 аптамер-миРНК химеры, в которых оба аптамер и миРНК части обладают мощным анти-ВИЧ. Кроме того, мы используем gp120 аптамер-миРНК химер для камерного типа конкретной доставки миРНК в ВИЧ-1 инфицированных клеток. Эта двойная функция химера показывает значительный потенциал для объединения различных нуклеиновых кислот терапевтических агентов (аптамер и миРНК) для подавления инфекции ВИЧ-1, что делает аптамер-миРНК химеры привлекательной терапевтической кандидатов для пациентов отсутствии высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ).

Protocol

1. Подготовка РНК библиотеку Начиная библиотеки ДНК содержит 50 нуклеотидов случайных последовательностей и был синтезирован Комплексная ДНК технологий (Coralville, штат Айова). Одноцепочечной ДНК олиго библиотеку последовательность 5'-GGG AGG ACG ATG CGG – N 50 – CAG ACG ACT CGC CCG – 3 "(81 п). Слу…

Discussion

Аптамеры в пробирке развивались нуклеиновых кислот, которые принимают конкретные и устойчивые трехмерные формы, тем самым обеспечивая высокую конкретные, жесткие привязки к целевой молекулы 8. Низкий наномолярных сродство и изысканные специфику аптамеры к цели сделать их ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Бритта Hoehn, Гуйхуа ВС, Харрис Сойфер и Лиза Шерер за полезные обсуждения. Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья и AI29329 HL07470 присуждена JJR следующие реагенты были получены через NIH исследований СПИДа и Программа Ссылка реагентов, Отдел СПИДа, NIAID, NIH: СНО-EE и СНО-gp160 ячейки линии; pNL4-3 Люк вектор; ВИЧ-1 БЛ gp120 из DAIDS, NIAID.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
MF-Millipore membrane filter Millipore HAWP01300 Pore size 0.45 μm
Swinnex Filter holder Millipore SX0001300 13 mm diameter
QIAquick Gel Extraction Kit QIAGEN 28706 DNA purification
Microcon YM-30 column Millipore 42410 RNA concentration
Bio-spin 30 column Bio-Rad 732-6250 RNA purification
Taq PCR DNA polymerase Sigma-Aldrich D1806  
ThermoScript RT-PCR system Invitrogen 11146-024  
DuraScribe T7 transcription Kit EpiCentre DS010925  
dNTP for PCR Roche 1 581 295  
Ribonucleic acid, transfer from E.coli Sigma-Aldrich R1753 tRNA competitor
HIV-1Ba-L gp120 protein the AIDS Research and Reference Reagent Program 4961 Target protein
Silencer siRNA labeling kit – Cy3 Ambion 1632  
Acid phenol/chloroform 5/1 solution (pH 4.5) Ambion AM9720  
Chloroform/Isopropanol 24/1 solution Sigma C0549  
Calf intestinal phosphatase (CIP) New England BioLab M0290L  
T4 polynucleotide kinase New England BioLab M0201L  
Glycogen Roche 10 901 393 001 RNA precipitation
Gamma-P32-ATP MP Biomedical 013502002 Radiactivity
40% AccuGel 19:1 National Diagnostics EC-850  
10xTBE National Diagnostics EC-860  
N,N,N,N’-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) Sigma-Aldrich T9281  
Ammonium persulfate (APS) Sigma-Aldrich A3678  
L-methioine sulfoximine Sigma-Aldrich M5379-250 mg  
RPMI Media 1640 Invitrogen 11835-030  
Sodium Bicarbonate solution, 7.5% w/v Invitrogen 25080-094  
Minimum Essential Medium (MEM) (10) Invitrogen 11430-030  
MEM non-essential amino acid (100) Invitrogen 11140-050  
TA cloning kit with pCR 2.1 Invitrogen K2040-01  

References

  1. Tuerk, C., Gold, L. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science. 249, 505-510 (1990).
  2. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346, 818-822 (1990).
  3. Robertson, D. L., Joyce, G. F. Selection in vitro of an RNA enzyme that specifically cleaves single-stranded DNA. Nature. 344, 467-468 (1990).
  4. Fitzwater, T., Polisky, B. A SELEX primer. Methods Enzymol. 267, 275-301 (1996).
  5. Weiss, C. D., White, J. M. Characterization of stable Chinese hamster ovary cells expressing wild-type, secreted, and glycosylphosphatidylinositol-anchored human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein. J Virol. 67, 7060-706 (1993).
  6. Vodicka, M. A. Indicator cell lines for detection of primary strains of human and simian immunodeficiency viruses. Virology. 233, 193-198> (1997).
  7. Zhou, J. Selection, characterization and application of new RNA HIV gp 120 aptamers for facile delivery of Dicer substrate siRNAs into HIV infected cells. Nucleic Acids Res. , (2009).
  8. Mayer, G. The chemical biology of aptamers. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 2672-2689 (2009).
  9. Famulok, M., Hartig, J. S., Mayer, G. Functional aptamers and aptazymes in biotechnology, diagnostics, and therapy. Chem Rev. 107, 3715-3743 (2007).
  10. Chu, T. C., Twu, K. Y., Ellington, A. D., Levy, M. Aptamer mediated siRNA delivery. Nucleic Acids Res. 34, e73-e73 (2006).
  11. McNamara, J. O., 2nd, . Cell type-specific delivery of siRNAs with aptamer-siRNA chimeras. Nat Biotechnol. 24, 1005-1015 (2006).
  12. Dassie, J. P. Systemic administration of optimized aptamer-siRNA chimeras promotes regression of PSMA-expressing tumors. Nat Biotechnol. 27, 839-849 (2009).
  13. Zhou, J., Rossi, J. J. The therapeutic potential of cell-internalizing aptamers. Curr Top Med Chem. 9, 1144-1157 (2009).
  14. Zhou, J., Li, H., Li, S., Zaia, J., Rossi, J. J. Novel dual inhibitory function aptamer-siRNA delivery system for HIV-1 therapy. Mol Ther. 16, 1481-1489 (2008).

Play Video

Citer Cet Article
Zhou, J., Li, H., Zhang, J., Piotr, S., Rossi, J. Development of Cell-type specific anti-HIV gp120 aptamers for siRNA delivery. J. Vis. Exp. (52), e2954, doi:10.3791/2954 (2011).

View Video