Développement d'un type de cellule spécifique anti-VIH gp120 aptamères pour la livraison de siRNA
Summary
Plusieurs 2'-fluoro aptamères d'ARN contre le VIH-1BA-L gp120 avec nanomole affinité sont isolées à partir d'une bibliothèque d'ARN en<em> In vitro</em> La procédure SELEX. Un nouveau double fonction inhibitrice anti-gp120 aptamère-siRNA chimère est créé et montre prometteur pour systémiques thérapie anti-VIH.
Abstract
L'épidémie mondiale d'infection par le VIH a créé un besoin urgent de nouvelles classes d'agents antirétroviraux. La puissante capacité d'interférents (SI) des ARN pour inhiber l'expression des transcrits d'ARN complémentaires est exploitée comme une nouvelle classe d'agents thérapeutiques pour une variété de maladies dont le VIH. Beaucoup de rapports précédents ont montré que les nouvelles stratégies à base RNAi anti-VIH/SIDA thérapeutiques très prometteurs, mais un obstacle majeur à l'application réussie thérapeutiques et la traduction clinique de siRNA est une livraison efficace. En particulier, compte tenu de la sécurité et l'efficacité des traitements à base RNAi, il est hautement souhaitable de développer une approche ciblée intracellulaire livraison de siRNA à des populations spécifiques de cellules ou de tissus. Le VIH-1 protéine gp120, une glycoprotéine de l'enveloppe sur la surface du VIH-1, joue un rôle important dans l'entrée virale dans les cellules CD4. L'interaction de la gp120 et du CD4 qui déclenche le VIH-1 entrée et initie la fusion cellulaire a été validé comme cliniquement pertinente anti-viraux stratégie de découverte de médicaments.
Ici, nous avons d'abord discuter de la sélection et l'identification de la 2'-F modifiés anti-VIH gp120 aptamères d'ARN. En utilisant une méthode SELEX nitrocellulose filtre classique, plusieurs aptamères nouvelle avec une affinité nanomolaire ont été isolés à partir d'un aléatoire 50 bibliothèques nt ARN. Pour réussir à obtenir des espèces lié avec une affinité plus élevée, la rigueur de sélection est soigneusement contrôlée en ajustant les conditions. Les aptamères sélectionnés peuvent se lier spécifiquement et rapidement être internalisés dans les cellules exprimant la protéine d'enveloppe du VIH-1. De plus, les aptamères seul peut neutraliser le VIH-1 infectant. Sur la base des meilleures aptamère A-1, nous créons également un roman à double fonction inhibitrice anti-gp120 aptamère-siRNA chimère dans laquelle les deux l'aptamère et les portions siARN ont une puissante activité anti-VIH. De plus, nous utilisons la gp120 aptamère-siRNA chimères pour un type de cellule spécifique de la livraison de siRNA sur le VIH-1 des cellules infectées. Cette double fonction chimère montre un potentiel considérable pour combiner divers agents acides nucléiques thérapeutiques (aptamère et de siRNA) à supprimer l'infection VIH-1, ce qui rend les chimères aptamère-siRNA attrayants candidats thérapeutiques pour les patients en échec thérapie antirétrovirale hautement active (HAART).
Protocol
Discussion
Les aptamères sont des acides nucléiques in vitro évolué qui supposent spécifique et stable des formes tridimensionnelles, offrant ainsi très spécifique, obligatoire serré pour 8 molécules ciblées. La faible affinité nanomolaire liaison et la spécificité exquise d'aptamères à leurs cibles en font des outils polyvalents pour le diagnostic, l'imagerie de vivo, et de la thérapeutique 9. Avec l'avènement de la technologie pour aptamère l…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Britta Hoehn, Guihua Soleil, Harris Soifer et Lisa Scherer pour les discussions utiles. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health et de AI29329 HL07470 attribué à JJR Les réactifs suivants ont été obtenus par la recherche des NIH sida et Référence Reagent Program, Division du sida, du NIAID, NIH: Le CHO-EE et CHO-gp160 cellulaire ligne; l'pNL4-3 Luc vecteur; VIH-1 gp120 du DAIDS BaL, le NIAID.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| MF-Millipore membrane filter | Millipore | HAWP01300 | Pore size 0.45 μm |
| Swinnex Filter holder | Millipore | SX0001300 | 13 mm diameter |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28706 | DNA purification |
| Microcon YM-30 column | Millipore | 42410 | RNA concentration |
| Bio-spin 30 column | Bio-Rad | 732-6250 | RNA purification |
| Taq PCR DNA polymerase | Sigma-Aldrich | D1806 | |
| ThermoScript RT-PCR system | Invitrogen | 11146-024 | |
| DuraScribe T7 transcription Kit | EpiCentre | DS010925 | |
| dNTP for PCR | Roche | 1 581 295 | |
| Ribonucleic acid, transfer from E.coli | Sigma-Aldrich | R1753 | tRNA competitor |
| HIV-1Ba-L gp120 protein | the AIDS Research and Reference Reagent Program | 4961 | Target protein |
| Silencer siRNA labeling kit – Cy3 | Ambion | 1632 | |
| Acid phenol/chloroform 5/1 solution (pH 4.5) | Ambion | AM9720 | |
| Chloroform/Isopropanol 24/1 solution | Sigma | C0549 | |
| Calf intestinal phosphatase (CIP) | New England BioLab | M0290L | |
| T4 polynucleotide kinase | New England BioLab | M0201L | |
| Glycogen | Roche | 10 901 393 001 | RNA precipitation |
| Gamma-P32-ATP | MP Biomedical | 013502002 | Radiactivity |
| 40% AccuGel 19:1 | National Diagnostics | EC-850 | |
| 10xTBE | National Diagnostics | EC-860 | |
| N,N,N,N’-Tetramethylethylenediamine (TMEMD) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| L-methioine sulfoximine | Sigma-Aldrich | M5379-250 mg | |
| RPMI Media 1640 | Invitrogen | 11835-030 | |
| Sodium Bicarbonate solution, 7.5% w/v | Invitrogen | 25080-094 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) (10) | Invitrogen | 11430-030 | |
| MEM non-essential amino acid (100) | Invitrogen | 11140-050 | |
| TA cloning kit with pCR 2.1 | Invitrogen | K2040-01 |
References
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