Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

1. Retroviral Construct hazırlayın Alt klon retroviral bir vektör içine ilgi T-hücre reseptör (TCR) geni (Şekil 1, 7 PMSG örnek vektörler, pMIGII 5,8, Cellbiolabs gelen pMXs). TCR α ve β zincir gen eşit ifade sağlamak için, aynı organizatörü kontrol altında aynı vektör olmalıdır. Ilgi TCR insan ise, insan sürekli etki fare sabit etki alanı 9 değiştirilmesi gerekir. Bizim gözlem de tam boy insan TCRS stably fare T-hücrelerinin ifade yoktur. Yüksek kalite plazmid DNA Qiagen Maxi Hazırlık Seti veya benzer bir ürün kullanarak hazırlayın. Plazmid konsantrasyonu yaklaşık 1 mcg / ml olmalıdır. 2. Transfeksiyon ve T-hücre İzolasyon Gün -1 (Levha ambalaj hücreleri) Platin-E (Plat-E, Cellbiolabs) tripsin-EDTA ile retroviral ambalaj hücreleri yerinden oynatın ve DMEM medya ile nötralize. 5 dakika için 1000 xg'de hücrelerin santrifüjleyin. Süpernatantı aspire ve DMEM medya hücre pelletini tekrar süspansiyon haline getirin. Hücre sayısını belirlemek ve 0.6×10 6 / mL hücreleri sulandırmak. Plaka 10mm bir poli-lizin kaplı doku kültürü plakasını hücre süspansiyonu 10 ml ve 37 kuvöz bir hücre gecede büyümek ° C,% 5 CO 2. Gün 0 (Transfeksiyon) Ertesi sabah, hafif bir mikroskop altında hücrelerin inceleyin. Hücrelerin yaklaşık% 80 konfluent olmalıdır. Plaka medya yavaşça çıkarın. 1x PBS ile bir kez yıkayın ve hücrelerin Penisilin-Streptomisin (Pen / Strep) olmadan 10 ml önceden ısıtılmış, taze DMEM medya ekleyin. (Not: Kalem / Strep transfeksiyon engelleyebilir) Transfeksiyon kompleksi hazırlayın. A ve B aşağıdaki gibi karışımı hazırlayın: Plazmid DNA: A karıştırın 9 mikrogram plazmid PCL-Eco yardımcı 6.3 mikrogram OptiMEM 1,5 mL Mix B: Lipopfectime 2000 60 mcL OptiMEM 1,5 mL Oda sıcaklığında 5 dakika için ayrı ayrı A ve B inkübe Nazikçe A ve B karıştırın ve transfeksiyon kompleks oluşturacak şekilde oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Plat-E hücrelerin içine yavaş yavaş karışımı (toplam 3 ml) damla. Yavaşça plaka transfeksiyon karışımı eşit olarak dağıtmak için ileri geri sallayın. 37 ° hücreleri inkübe ° C /% 5 CO 2 hücre inkübatör. 6-8 saat sonra taze DMEM orta viral üretimi için 10 ml (Kalem / Strep ile) orta yerine. Antikorlar ile Coat plaka Fare T-hücrelerinin viral transdüksiyon önce aktif hale getirilmesi gerekir. T-hücrelerinin aktive etmek için çeşitli yolları vardır. Burada plaka bağlı anti-CD3e ve anti-CD28 antikorları kullanın. 1 mcg / ml ve anti-CD3e 2 mcg / ml steril PBS anti-CD28 antikor karışımı hazırlayın. 24-iyi bir doku kültürü plakasının her bir kuyunun 250 mcL antikor karışımı koyun. Plaka 37 4 ° C veya 2 saat gece kaplı ° C. Fare dalak tek hücre süspansiyonu hazırlanması Hasat fare dalak ve RPMI medyum transfer. Dalak bir hücre süzgeç koyun. 5 cm doku kültürü plaka içine bir şırınga pistonu ezerek dalak. Steril PBS ile hücre süzgeç kapalı hücre durulayın. 1000 xg, 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatant atın. ACK parçalama tampon yeniden süspanse hücre pelet (dalak başına 2 ml). Oda sıcaklığında 2 ila 3 dakika inkübe edin. 20 ml RPMI orta ekleyin ve 5 dakika boyunca 1000 xg santrifüj. Süpernatant atın. Steril PBS içinde yeniden süspanse hücre pelet. 4 5 dakika hücre sayısı ve santrifüj ile 1000 xg ° C belirleyin T-hücre izolasyonu devam edin. Fare T-hücrelerinin izolasyonu ve aktivasyon Manyetik ürün kılavuzuna (CD8 + Miltenyi Biotec T-hücre izolasyon kiti) göre hücrelerin etiket. M bir LS sütun (Miltenyi Biotec) yerleştirin.agnetic alanında. Etiketli hücre süspansiyonu sütun üzerine uygulayın. (Fare CD8 + T-hücrelerinin zenginleştirilmiş) ile akış toplayın. Ürün kılavuzuna göre 3 mL tampon sütun üç kez yıkayın ve flow-through önceki birleştirmek. Leke ve anti-CD3e ve anti-CD8a antikorlar ile hücreler flow sitometri ile analiz (Şekil 2a). Tipik bir ayırma için, yaklaşık% 8-10 toplam hücreleri izole edilebilir. ~ Izole hücrelerinin% 90, CD8 + T-hücrelerinin. 1000 xg, 5 dakika hücreleri santrifüjleyin. Süpernatantı atın. Rekombinant insan IL-2 (rhIL2, 20 ng / ml) 1×10 6 / ml RPMI medyum içinde hücre pelletini tekrar. Sadece hücreleri eklemeden önce, plaka (2.11 önceden hazırlanmış) antikor çözüm kaldırmak. Her steril PBS ve kaldır PBS ile iyice durulayın. 1 ml hücre süspansiyonu, her bir kuyunun ekleyin. 37 ° C /% 5 CO 2 inkübatör bir hücre tabak koyun. 3. Aktif (Gün 2 Gün 3) Enfeksiyon T-hücrelerinin 2 gün sonra virüs üretim, Plat-E hücre plakasını orta sarı haline gelmelidir. 15 ml konik tüp viral süpernatant aktarın. Daha fazla viral üretim plaka (isteğe bağlı) 10 ml taze DMEM orta ekleyin. Hücrelerin enkaz kaldırmak için 5 dakika için 1000 xg'de virüs süpernatant santrifüjleyin. Yeni bir tüp virüs süpernatant dikkatlice aktarın. Borunun alt kısmında bir miktar sıvı bırakın ve hücrelerin enkaz rahatsız etmeyin. Toplayın plakadan 50 ml konik tüp içine T-hücrelerinin aktive. Hücre sayısını belirler. (Un transduced) negatif kontrol olarak kullanılmak üzere ayrı bir tüpe bazı hücreler kaydedin. 5 dakika için 1000 xg'de santrifüjleyin ve supernatant atın. 20 ng / ml rhIL2 ve 10 mg / ml protamin sülfat ile 1 ml başına 10 6 hücre virüs süpernatant hücre pelletini tekrar. 24 plaka her bir kuyu için 1 ml hücre süspansiyonu ekleyin. Aynı miktarda rhIL2 ve protamin sülfat ile aynı hücre yoğunluğu RPMI orta kontrol tüpü hücrelerin tekrar Hücreler aynı plaka ekleyin. Plaka plastik film ile sarın. Herhangi bir fren ile 32 ° C'de 90 dakika, 2000 xg'de santrifüjleyin. Santrifüj sonra, plastik folyoyu çıkarın. 1 ml taze RPMI medyum her bir kuyu için 20 ng / ml rhIL2 ekleyin. Inkübatör geri plaka koyun. (Isteğe bağlı) TCR Yükseköğretim ekspresyon seviyesi virüs süpernatant toplama ve 3. gününde enfeksiyon prosedürü tekrar elde edilebilir. 4. Hücre Genişleme ve İletimi Verimliliği Değerlendirme Inceleyin günlük T-hücrelerinin transduced. Split gerektiğinde RPMI orta rhIL2 01:03 oranları hücreler. Hücreleri büyümek (orta sarıya döner) izin vermeyin. Günde 6 ya da 7 gün, antikor ve T-hücre yüzeyinde TCR ifade değerlendirmek için TCR için özel bir MHC tetramer ile hücre leke. Kullanarak kontrol olarak T hücreleri (Şekil 2c) un transduced. T-hücrelerinin transduced daha aşağı uygulamalar için hazır. 5. Temsilcisi Sonuçlar Splenositlerin arıtma olmadan transduced olmasına rağmen transdüksiyon önce T-hücre alt arındırmak için genellikle avantajlıdır. Yüksek saflıkta T-hücre alt grupları, ticari manyetik boncuk (Şekil 2a) kullanılarak elde edilebilir. T-hücrelerinin TCRS ifade düzeyini değerlendirmek için, TCR alfa veya beta zincirleri için özel antikorlar kullanılabilir. Genellikle hücrelerin% 30 -% 80 ifade TCR genleri ve virüs titreleri bağlı olarak TCR transduced (Şekil 2b). MHC tetramer özgü TCR için daha da işlevsel TCRS ifade (Şekil 2c) doğrulamak için kullanılan olabilir. Şekil 1. Örnek T-hücre reseptör geni inşa alt klonlanmış retroviral bir vektör içine kendi kendine cleavable 2A peptid ilintileyici 8 Tam boy alfa ve beta zincirinin genleri ile bağlantılı. Şekil 2. Fare T-hücrelerinin başarılı bir şekilde izolasyonu ve transdüksiyon Örnek (a) CD8 T hücreleri kullanarak splenositlerin CD8a + T Hücre İzolasyon Kiti (Miltenyi Biotec) ve anti-CD3e ve anti-CD8a antikorlar ile boyanarak izole edilmiştir. 209 -217 4 peptid anti-insan Vbeta 8 antikor (b) ve HLA-A2kb gp100 tetramer (c) ve vitray: CD8 T hücreleri izole insan gp100 R6C12 TCR özel transduced edildi.