התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

1. הכן Construct retroviral תת לשבט את T-cell receptor (TCR) הגן של עניין לתוך וקטור retroviral (איור 1, וקטורים למשל pMSG 7, pMIGII 5,8, pMXs מ Cellbiolabs). Α TCR ו – גן שרשרת β צריך להיות על אותו וקטור בשליטת היזם אותו כדי להבטיח ביטוי שווה. אם TCR עניין אנושי, אנושי התחומים קבוע צריך להיות מוחלף על ידי תחומים עכבר קבוע 9. תצפית שלנו היא TCRs באורך מלא אדם אינם מבטאים ביציבות על העכבר מתאי T. הכן את ה-DNA באיכות גבוהה באמצעות פלסמיד Qiagen מקסי Prep קיט או מוצר דומה. ריכוז הפלסמיד צריך להיות סביב 1 מיקרוגרם / μL. 2. Transfection ו-T-cell בידוד יום -1 (אריזה תאים פלייט) לעקור Platinum-E (Plat-E, Cellbiolabs) תאים אריזה retroviral עם טריפסין-EDTA ולנטרל DMEM עם התקשורת. צנטריפוגה התאים XG ב 1000 עבור 5 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב DMEM התקשורת. קבע את מספר התא לדלל את התאים ב 0.6×10 6 / mL. פלייט 10 מ"ל של השעיה תא צלחת 10mm poly-ליזין מצופה תרבות רקמות לגדול בין לילה בתא החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. יום 0 (transfection) למחרת בבוקר, לבחון את התאים תחת מיקרוסקופ אור. התאים צריכים להיות כ -80% ומחוברות. להסיר בעדינות את התקשורת מן הצלחת. לשטוף את התאים פעם עם 1x PBS ולהוסיף 10 מ"ל מראש חימם, טרי DMEM התקשורת ללא סטרפטומיצין, פניצילין (פן / סטרפטוקוקוס). (הערה: פן / סטרפטוקוקוס יכול להפריע transfection) הכן מורכב transfection. הכינו תערובת A ו-B כדלקמן: מערבבים: DNA פלסמיד 9 מיקרוגרם PCL-Eco פלסמיד עוזר 6.3 מיקרוגרם OptiMEM 1.5 מ"ל מערבבים B: Lipopfectime 2000 60 μL OptiMEM 1.5 מ"ל דגירה A ו-B בנפרד במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר מערבבים A ו-B יחד בעדינות דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור מורכבות transfection. לאט לאט לטפטף את התערובת (מ"ל סה"כ 3) לתוך Plat-E תאים. רוק בעדינות את הצלחת קדימה ואחורה כדי לפזר את התערובת באופן שווה transfection. דגירה התאים ב 37 ° CO 5 / 2% בשנת חממה התא. לאחר 6-8 שעות, להחליף בינוני עם 10 מ"ל של מדיום DMEM טריים (עם פן / סטרפטוקוקוס) לייצור ויראלי. סמל צלחת עם נוגדנים עכבר מתאי T צריך להיות מופעל לפני התמרה ויראלית. ישנן דרכים שונות כדי להפעיל את T-תאים. כאן אנו משתמשים מחויב צלחת נוגדנים נגד CD3e ו CD28 אנטי. הכינו תערובת נוגדנים של 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אנטי CD3e ו 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אנטי CD28 ב PBS סטרילית. לוותר על 250 μL של תערובת נוגדנים היטב כל צלחת 24 גם בתרבית רקמה. צלחת יכול להיות מצופה בכל לילה בשעה 37 ° C 4 שעות או 2 ° C. הכנת ההשעיה תא בודד מתוך טחול עכבר עכבר קציר הטחול ולהעביר בינוני RPMI. מניחים את הטחול בתוך מסננת התא. מועכים את הטחול עם הבוכנה מזרק לתוך צלחת 5 ס"מ תרבות רקמות. יש לשטוף את התאים מסננת את התא עם סטרילי PBS. צנטריפוגה 1000 XG, 5 דקות. בטל supernatant. Resuspend תא גלולה במאגר lysing ACK (2 מ"ל לכל טחול). דגירה 2-3 דקות בטמפרטורת החדר. הוסף RPMI בינוני עד 20 מ"ל ו – 1000 צנטריפוגות XG דקות 5. בטל supernatant. Resuspend תא גלולה ב סטרילי PBS. קביעת מספר תאים 1000 XG צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 4 ° C. המשך בידודה של תא-T. ניתוק והפעלה של העכבר מתאי T מגנטית התווית תאים על פי המדריך של המוצר (CD8 + T-cell ערכת בידוד Miltenyi BIOTEC). המקום טור LS (Miltenyi BIOTEC) ב מ 'agnetic השדה. החל ההשעיה תא שכותרתו על הטור. איסוף flow-through (מועשר עכבר CD8 + T-תאים). לשטוף את העמודה שלוש פעמים עם חיץ 3 מ"ל לפי ידנית את המוצר לשלב הקודם עם זרימה דרך. הכתם התאים עם נוגדנים אנטי CD3e ואנטי CD8a ולנתח ידי cytometry זרימה (איור 2 א). עבור הפרדה טיפוסי, ~ 8-10% של תאים הכולל יכול להיות מבודד. ~ 90% של תאים בודדים הם CD8 + T-תאים. צנטריפוגה התאים XG ב 1000, 5 דק '. בטל supernatant. Resuspend התא גלולה במדיום RPMI עם רקומביננטי אנושי IL-2 (rhIL2, 20 ng / mL) בשעה 1×10 6 / mL. רק לפני הוספת תאים, להסיר פתרון נוגדן מהצלחת (הכין בעבר 2.11). יש לשטוף היטב עם כל PBS סטרילית להסיר PBS. הוסף 1 מ"ל של ההשעיה התא היטב כל אחד. שים את הצלחת ב 37 ° C / 5% CO 2 בתוך תא חממה. 3. (יום 2 ויום 3) של זיהום פעיל מתאי T אחרי 2 ימים של הפקה וירוס, המדיום בצלחת Plat-E התא צריך להיות צהוב. העברת supernatant ויראלי צינור חרוטי 15 מ"ל. הוסף 10 מ"ל של מדיום DMEM טרי לצלחת לייצור ויראלי נוסף (אופציונלי). צנטריפוגה supernatant וירוס XG ב 1000 דקות 5 להסיר פסולת תאים. בזהירות supernatant העברת הנגיף צינור חדש. השאירו כמה נוזלים בתחתית הצינור לא להפריע פסולת תאים. איסוף מופעל מתאי T מהצלחת לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. קבע את מספר התא. שמור כמה תאים לתוך צינור נפרד לשמש מלאה (בלתי transduced) שלילי. צנטריפוגה XG ב 1000 עבור 5 דקות וזורקים supernatant. Resuspend התא בנגיף supernatant גלולה בשעה 10 6 תאים לכל 1 מ"ל עם rhIL2 20 נ"ג / מ"ל ו – 10 מיקרוגרם / מ"ל של סולפט protamine. הוסף 1 מ"ל של השעיה התא היטב כל צלחת גם 24. Resuspend התאים בצינור השליטה במדיום RPMI בצפיפות באותו תא עם אותה כמות של סולפט rhIL2 ו protamine. הוסף את התאים צלחת זהה. לעטוף את הצלחת עם סרט פלסטי. צנטריפוגה 90 דקות XG 2000, בשעה 32 ° C עם הבלם לא. לאחר צנטריפוגה, הסר את סרט פלסטי. הוסף 1 מ"ל של מדיום RPMI טרי עם 20 ng / mL rhIL2 היטב כל אחד. שים את הצלחת בחזרה אל האינקובטור. (אופציונאלי) רמת ביטוי גבוהה של TCR ניתן להשיג על ידי איסוף supernatant וירוס ולחזור על הליך זיהום ביום 3. 4. הרחבת תאים והערכה של יעילות התמרה בדוק את transduced מתאי T יומי. פצל את התאים על יחסי 01:03 בעת הצורך ב RPMI בינוני rhIL2. אל תתנו לגדול יותר תאים (בינוני פונה צהוב). באותו יום 6 או 7 יום, כתם התאים עם הנוגדנים ו tetramer MHC ספציפי עבור TCR להעריך את הביטוי של TCR על פני תא T. שימוש בלתי transduced מתאי T כמו הביקורת (איור 2 ג). Transduced מתאי T מוכנים עבור יישומים נוספים במורד הזרם. 5. נציג תוצאות לעיתים קרובות יתרון לטהר T-cell תת לפני התמרה למרות splenocytes ניתן transduced ללא טיהור. גבוהה T-cell תת טוהר ניתן להשיג באמצעות חרוזים מגנטיים מסחרי (איור 2 א). כדי להעריך את רמת הביטוי של TCRs על מתאי T, נוגדנים ספציפיים עבור TCR אלפא או בטא שרשרות ניתן להשתמש. בדרך כלל 30% עד 80% של התאים יכולים להביע transduced TCR (איור 2b) בהתאם הגנים TCR ו titers וירוס. MHC ספציפי tetramer עבור TCR יכול לשמש גם כדי לקדם לאמת ביטוי פונקציונלית של TCRs (איור 2 ג). באיור 1. דוגמה של הגן T-cell receptor לבנות תת משובטים לתוך וקטור retroviral. אלפא אורך מלא וגנים שרשרת בטא מחוברים באמצעות מקשר עצמית cleavable 2A פפטיד 8. איור 2. דוגמה של בידוד התמרה מוצלח של העכבר מתאי T. (א) CD8 T-תאים היו מבודדים splenocytes באמצעות CD8a + בידוד T Cell Kit (Miltenyi BIOTEC) ומוכתמת עם נוגדנים אנטי CD3e ואנטי CD8a. מבודד CD8 T-תאים היו transduced עם R6C12 TCR ספציפי עבור האדם gp100: 209 -217 4 פפטיד ומוכתמת עם נוגדן אנטי אנושי Vbeta 8 (ב) ו – HLA-A2kb gp100 tetramer (ג).