T细胞受体在小鼠T细胞的逆转录病毒转导

1。准备逆转录病毒载体构建小组克隆利益的T细胞受体（TCR）基因逆转录病毒载体（图1，例如向量，PMSG 7，pMIGII 5,8，从Cellbiolabs pMXs） 。的TCRα和β链基因应该是相同的启动子控制下的同一载体上，以确保平等的表达。如果感兴趣的TCR是人类，人类不断域需要将鼠标不断域9更换。我们的观察是，全长人类电阻温度系数并不稳定表达对小鼠T细胞。 准备高质量的质粒DNA用Qiagen公司马克西准备试剂盒或类似的产品。质粒的浓度应在约1微克/μL。 2。转染和T细胞隔离日-1（板包装细胞） 打跑铂- E（PLAT – E Cellbiolabs）用胰蛋白酶- EDTA的逆转录病毒包装细胞，用DMEM媒体和压制。 离心5分钟在1000 XG的细胞。吸上清，悬浮细胞沉淀的DMEM媒体。 确定细胞数量和0.6×10 6 /毫升稀释的细胞。板10毫升细胞悬浮在一个10mm的多聚赖氨酸涂层的组织培养板和一个细胞培养箱中过夜增长在37℃，5％的CO 2。 0天（转） 第二天早晨，检查光显微镜下的细胞。应约80％融合的细胞。 轻轻地从板中删除媒体。一次1X PBS清洗细胞，并没有青霉素，链霉素（PEN /链球菌）添加10毫升的预热，新鲜的DMEM媒体。 （注：笔/链球菌可以干扰与转） 准备转染复杂。 准备组合A和B如下： 混合：质粒DNA 9微克 PCL – ECO辅助质粒 6.3微克 OptiMEM 1.5毫升混合物B：Lipopfectime 2000 60微升 OptiMEM 1.5毫升孵育5分钟A和B分别在室温混合A和B一起轻轻为20分钟，在室温下孵育形式转复杂。 慢慢地滴入开发平台- E细胞的混合物（共3毫升）。轻轻摇动板来回的转染混合物均匀地分发。 细胞在37 ° C / 5％的CO 2在细胞培养箱。 6-8小时后，取代病毒生产的新鲜DMEM培养基用10 mL（与PEN /链球菌）的媒介。 涂层板与抗体小鼠T细胞病毒转导前需要激活。有各种方法来激活T细胞。在这里，我们用板的约束反CD3e和抗CD28抗体。准备1微克/毫升抗CD3e和2微克/毫升无菌PBS的抗CD28抗体的混合物。 分送250μL抗体的混合物，每孔24孔组织培养板。该板块可以涂在一夜之间在4 ° C或2小时37 ° C。 从小鼠脾脏单细胞悬浮液的制备收获小鼠脾和转移的RPMI培养基。 将单元格中的过滤器的脾。捣碎成一个5厘米的组织培养板的注射器柱塞脾。用无菌PBS冲洗掉细胞过滤器的细胞。 离心1000 XG，5分钟。 弃上清。在确认裂解缓冲液悬浮细胞沉淀（2％毫升脾）。孵育2〜3分钟在室温。添加20毫升的RPMI培养基，离心5分钟XG 1000。 弃上清。悬浮细胞沉淀在无菌PBS。确定细胞数为5分钟，离心1000 XG在4 ° C。进入T细胞的分离。 小鼠T细胞的分离和激活根据产品说明书（CD8 + T细胞分离试剂盒从美天旎生物技术），磁标签的细胞。 放置在米LS列（美天旎生物技术）agnetic领域。应用到的列标记的细胞悬液。收集流量通过（丰富小鼠CD8 + T细胞）。列洗净，用3 mL缓冲三次，根据产品说明书并结合与以前流过。 反CD3e和反CD8a抗体染色的细胞，并通过流式细胞仪分析（图2a）。对于一个典型的分离，细胞总数的8-10％可以被孤立。 〜90％，分离出的细胞CD8 + T细胞。 离心机在1000 XG，5分钟的细胞。上清液。重组人IL – 2（rhIL2，20毫微克/毫升）在1 × 10 6 /毫升，重悬细胞沉淀于RPMI培养基。 之前加入的细胞，取出板（准备在2.11以前）抗体的解决方案。每孔用无菌PBS和删除PBS冲洗。 加入1毫升细胞悬液，每孔。置于37 ° C / 5％CO 2细胞培养箱中板。 3。 （2和第3天天）感染T细胞激活经过2天的病毒生产，在开发平台- E细胞板的介质应变成黄色。病毒上清转移到15 mL锥形管。添加10毫升的新鲜DMEM培养基为进一步的病毒生产板（可选）。 离心5分钟，以去除细胞碎片在1000 XG病毒上清。小心病毒上清转移到一个新的管。保留一些液体的试管底部，不打扰细胞碎片。 从板材到50 mL锥形管收集激活T细胞。确定细胞数量。保存到一个单独的管为阴性（未转）控制使用的一些细胞。离心机在1000 XG 5分钟，弃上清。 重悬在10 6细胞每1毫升20毫微克/毫升rhIL2和10微克/毫升硫酸鱼精蛋白在病毒上清的细胞沉淀。加入1 ml的细胞悬液，每孔24孔板。 rhIL2和硫酸鱼精蛋白的相同数额相同的细胞密度控制在RPMI培养基管重悬细胞。添加细胞相同的板。 包装用塑料薄膜板。在2000年的XG离心90分钟，在32 ° C，没有刹车。 离心后，取出塑料薄膜。 1毫升新鲜的RPMI培养基添加20 ng / mL的rhIL2每口井。把板的孵化器。 （可选）的表达水平较高的TCR可以通过收集病毒上清，重复3天的感染过程。 4。扩展的细胞和转染效率的评价检查每日转导的T细胞。拆分在必要时在RPMI培养基rhIL2 1:3比例的细胞。不要让细胞长满（中等变为黄色）。 在6或第7天天，染色与抗体和MHC四聚体，以评估对T细胞表面的TCR的表达特定的TCR细胞。使用未转导的T细胞作为对照（图2c）。 导的T细胞，准备进一步的下游应用。 5。代表性的成果它往往是有利的，净化前转导的T细胞亚群，虽然脾可以不净化转。使用商业磁珠（图2a），可以得到高纯度的T细胞亚群。 要评估的T细胞上的电阻温度系数的表达水平，可用于特定抗体TCRα或β链。通常30％至80％的细胞可以表达转导TCR（图2b）根据TCR的基因和病毒滴度。 MHC四聚体为特定的TCR也可用于进一步验证功能表达的电阻温度系数（图2c）。 图1。 T细胞受体基因的例子构造子克隆到逆转录病毒载体 。全长α和β链基因的自我裂解2A肽连接器8挂钩。 图2。成功分离和小鼠T细胞的转导。范 ​​例（一）使用CD8a + T细胞分离试剂盒（美天旎生物技术公司）和反CD3e和反CD8a抗体染色脾CD8 + T细胞隔离。隔离CD8 + T细胞的转R6C12的TCR具体为人类GP100：209 -217 4肽与抗人Vbeta 8抗体（b）和HLA – A2kb GP100四聚体（C）染色。