Transdução retroviral de receptor de células T no rato células T

1. Prepare Construct Retroviral Sub-clone do T-cell receptor gene (TCR) de interesse em um vetor retroviral (Figura 1, os vetores exemplo PMSG 7, pMIGII 5,8, pMXs de Cellbiolabs). A TCR α e gene da cadeia β deve estar no mesmo vetor sob o controle do mesmo promotor para garantir a expressão igual. Se o TCR de interesse é humano, os domínios humanos constante necessidade de ser substituído por domínios do mouse constante 9. Nossa observação é que TCRs comprimento total humanos não expressar de forma estável no mouse células-T. Prepare DNA de alta qualidade utilizando plasmídeo Maxi Kit Qiagen Prep ou produto similar. A concentração do plasmídeo deve ser em torno de 1 mg / mL. 2. Transfecção de células T e de isolamento Dia -1 (células embalagem Plate) Desalojar Platinum E-(Plat-E, Cellbiolabs) células embalagem retroviral com tripsina-EDTA e neutralizar com DMEM mídia. Centrifugar as células a 1000 xg por 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em DMEM mídia. Determinar o número de células e diluir as células de 0.6×10 6 mL /. ML placa, 10 de suspensão de células em uma placa de cultura 10 milímetros poli-lisina revestido de tecido e crescer durante a noite em uma cela incubadora a 37 ° C, 5% CO 2. Dia 0 (transfecção) Na manhã seguinte, examine as células em um microscópio de luz. As células devem ser aproximadamente 80% confluentes. Remova cuidadosamente os meios de comunicação da placa. Lave as células uma vez com PBS 1x e adicionar 10 mL pré-aquecido, fresca DMEM mídia sem penicilina-estreptomicina (Pen / Strep). (Nota: Pen / Strep podem interferir com a transfecção) Prepare complexo transfecção. Preparar a mistura A e B da seguinte forma: Uma mistura: DNA plasmidial 9 mg PCL-Eco helper plasmídeo 6,3 mg OptiMEM 1,5 mL Mix B: Lipopfectime 2000 60 mL OptiMEM 1,5 mL Incubar A e B separadamente por 5 minutos em temperatura ambiente Mix A e B juntos suavemente e incubar por 20 minutos em temperatura ambiente para formar complexos transfecção. Gotejamento lentamente a mistura (de 3 mL total) para as células Plat-E. Agite levemente o prato para trás e para distribuir a mistura de transfecção uniformemente. Incubar as células a 37 ° CO C / 5 2% em uma incubadora de celular. Depois de 6-8 horas, substituir média com 10 mL de meio DMEM fresco (com Pen / Strep) para a produção viral. Placa de revestimento com anticorpos Rato células-T precisam ser ativados antes de transdução viral. Há uma variedade maneiras para ativar as células-T. Aqui usamos placa ligado anticorpos anti-CD28 CD3e e anti-. Prepare uma mistura de anticorpos de 1 mg / mL de anti-CD3e e 2 mg / mL de anti-CD28 em PBS estéril. Dispense 250 L da mistura de anticorpos em cada poço de uma placa de cultura de 24 poços de tecido. A placa pode ser revestido durante a noite a 4 horas ou 2 ° C a 37 ° C. Preparação de uma única célula de suspensão de baço de rato Baço colheita mouse e transferência para meio RPMI. Coloque o baço em um coador de celular. Mash o baço com um êmbolo da seringa em uma placa de cultura 5 centímetros de tecido. Enxágüe células fora do filtro de células com PBS esterilizado. Centrífuga 1000 xg, 5 min. Elimine o sobrenadante. Ressuspender pellet celular em tampão de lise ACK (2 mL por baço). Incubar 2-3 min à temperatura ambiente. Adicionar meio RPMI até 20 mL e centrifugar 1000 xg por 5 min. Elimine o sobrenadante. Ressuspender celular em PBS estéril. Determinar o número de células e xg centrífuga 1000 para 5 min a 4 ° C. Proceder ao isolamento de células-T. Isolamento e ativação de células T do mouse Magneticamente rótulo as células de acordo com o manual do produto (CD8 + kit de isolamento de células T de Miltenyi Biotec). Colocar uma coluna LS (Miltenyi Biotec), no magnetic campo. Aplicar suspensão de células marcado para a coluna. Colete de fluxo (enriquecido rato CD8 + T-cells). Lavar a coluna três vezes com 3 mL de tampão de acordo com o manual do produto e combinar com o anterior por escoamento. Mancha as células com anticorpos anti-CD3e e anti-CD8a e analisar por citometria de fluxo (Figura 2a). Para uma separação típica, ~ 80-10% do total de células podem ser isoladas. ~ 90% das células CD8 + são isoladas células-T. Centrifugar as células a 1000 xg, 5 min. Desprezar o sobrenadante. Ressuspender o pellet celular em meio RPMI com recombinante humana IL-2 (rhIL2, 20 ng / mL) em 1×10 6 / mL. Pouco antes de adicionar as células, remoção da solução de anticorpos da placa (previamente preparado em 2.11). Enxágüe bem cada com PBS estéril e PBS remover. Adicionar 1 mL da suspensão de células em cada poço. Colocar a placa a 37 ° C / 5% CO 2 em uma célula incubadora. 3. (Dia 2 e dia 3) Infecção de células T ativadas Após dois dias de produção de vírus, o meio na placa de células Plat-E deve tornar-se amarelo. Transfira o sobrenadante viral a um tubo de 15 mL cônico. Adicionar 10 mL de meio DMEM fresco para a placa para a produção viral mais (opcional). Centrífuga sobrenadante vírus em 1000 xg por 5 min para remover detritos células. Transferir cuidadosamente o sobrenadante vírus para um novo tubo. Deixe um pouco de líquido na parte inferior do tubo e não perturbe os restos de células. Coletar células T ativadas a partir da placa em um tubo cônico de 50 mL. Determinar o número de células. Salvar algumas células em um tubo separado para ser usado como controle (não-transduzidas) negativo. Centrifugar a 1000 xg por 5 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender o pellet celular em vírus sobrenadante a 10 6 células por 1 mL com 20 ng / mL rhIL2 e 10 mcg / ml de sulfato de protamina. Adicionar 1 mL de suspensão de células em cada poço de uma placa de 24 poços. Ressuspender as células no tubo de controle em meio RPMI na densidade das células mesmo com a mesma quantidade de sulfato de protamina e rhIL2. Adicionar as células a mesma placa. Embrulhe a placa com filme plástico. Centrifugar 90 minutos a 2000 xg, a 32 ° C, sem freio. Após a centrifugação, remover o filme plástico. Adicionar 1 mL de meio RPMI fresco com 20 ng / mL rhIL2 a cada poço. Coloque a placa de volta para a incubadora. (Opcional) Nível Superior expressão de TCR podem ser alcançados através da coleta do sobrenadante vírus e repetir o procedimento de infecção no dia 3. 4. Expansão das células e Avaliação da Eficiência Transdução Examine o transduzidas células T diariamente. Dividir as células em proporções 01:03, quando necessário, em meio RPMI rhIL2. Não deixe que a overgrow células (média fica amarelo). No dia 6 ou 7 dias, mancha as células com o anticorpo e tetrâmero MHC específico para o TCR para avaliar a expressão da TCR em células T de superfície. Use o un-transduzidas células-T como controle (Figura 2c). O transduzidas células-T estão prontos para novas aplicações a jusante. 5. Resultados representante Muitas vezes é vantajoso para purificar de células T subconjuntos antes de transdução embora esplenócitos pode ser transduzidas sem purificação. Alta pureza de células T subconjuntos pode ser obtida usando comercial esferas magnéticas (Figura 2a). Para avaliar o nível de expressão de TCRs sobre as células T, anticorpos específicos para TCR alfa ou beta cadeias podem ser usados. Tipicamente 30% a 80% das células podem expressar transduzidas TCR (Figura 2b), dependendo do genes TCR e os títulos de vírus. MHC específico tetrâmero para a TCR também pode ser usado para comprovar expressão funcional de TCRs (Figura 2c). Figura 1. Exemplo de células T do gene do receptor construir sub-clonado em um vetor retroviral. Alpha de comprimento total e genes de cadeia beta estão ligadas por uma auto-linker peptídeo clivável 2A 8. Figura 2. Exemplo de isolamento bem sucedido e transdução de células T do mouse. (A) células-T CD8 foram isoladas de esplenócitos usando CD8a + T Celular Isolation Kit (Miltenyi Biotec) e corados com anticorpos anti-CD3e e anti-CD8a. Isolado células-T CD8 foram transduzidas com R6C12 TCR específico para humanos gp100: 209 -217 peptídeo 4 e corados com anti-humano Vbeta 8 de anticorpos (b) e HLA-A2kb gp100 tetrâmero (c).