Overview
Denne videoen beskriver en myk agar koloni formasjon analyse for å teste effekten av en PADI enzymhemmer og BB-Cl-amidine på brystkreft tumorigenicity in vitro. Denne analysen muliggjør også kvantitativ vurdering av celletransformasjonspotensial innenfor konteksten av genetiske perturbasjoner.
Protocol
1. Tilberedning av 3% 2-Hydroksyetyl Agarose
- I en ren, tørr 100 ml glassflaske, tilsett 0,9 g 2-hydroksyetyl agarose (Agarose VII) etterfulgt av 30 ml destillert vann.
- Mikrobølgeovn blandingen i 15 sek og virvle forsiktig. Gjenta dette trinnet minst tre ganger til agarosepulveret helt oppløses.
- Autoklaver den løsningsholdige flasken i 15 min.
- La agaroseløsningen avkjøles til RT før videre bruk. Oppbevar løsningen hos RT.
2. Forberedelse av bunnlaget: 0,6% Agarose Gel
- Forvarm flere 5 ml og 10 ml pipetter i en 37 °C inkubator for å forhindre at agaroseen størkner i pipetten ved håndtering.
- Løsne flaskelokket delvis og mikrobølgeovn den ferdiglagde 3% 2-hydroksyetyl agarose oppløsningen i 15 sek. Virvle deretter forsiktig løsningen og mikrobølgeovnen i ytterligere 15 sek.
FORSIKTIG: Vær forsiktig når du virvler agaroseløsningen fordi løsningen stiger opp når den utsettes for luft og kan smitte over. - Hvis det er gjenværende solid gel i flasken, mikrobølgeovn i noen sekunder til.
- Oppbevar flasken som inneholder agaroseoppløsningen i et 45 °C vannbad i de neste trinnene for å forhindre at agaroseløsningen størkner for tidlig.
- Varm MCF10DCIS media i et 37 °C vannbad.
MERK: MCF10DCIS media består av DMEM / F12, 5% hesteserum, 5% penicillin streptomycin. - Overfør 3 ml av den 3% agarose oppløsningen ved hjelp av de forvarmede pipettene til et sterilt 50 ml konisk rør.
- Tilsett umiddelbart 12 ml varme MCF10DCIS-medier og inverter forsiktig det koniske røret for å blande agarose med media. Prøv å ikke danne noen bobler, da det vil forstyrre kolonitellingen senere.
- Tilsett forsiktig 2 ml av denne blandingen i hver brønn av en 6-brønns kulturplate uten å danne noen luftbobler.
- Inkuber 6-brønns kulturplaten horisontalt på en flat overflate ved 4 °C i 1 time slik at blandingen kan størkne.
- Etter at blandingen størkner, plasser platen i en 37 °C inkubator i 30 minutter. Det nederste laget er nå klart til bruk.
3. Tilberedning av det celleholdige laget: 0,3% Agarose Gel
- Prøv MCF10DCIS-celler og fortynn dem til en cellekonsentrasjon på 4 x 104 /ml.
- Ta 2 ml av 3% agarose ved hjelp av forvarmede pipetter og overfør til et sterilt 50 ml konisk rør.
- Tilsett umiddelbart 8 ml MCF10DCIS-medier i det koniske røret og inverter forsiktig for å blande agarose med media. Unngå å danne noen bobler.
- Ta 2 ml av MCF10DCIS-cellene (4 x 104 /ml) og behandle med BB-CLA (0 μM (DMSO) eller 1 μM).
- I en 1:1 fortynning blander du cellene med 0,6% agarose.
- Ta 1 ml av celle-agaroseblandingen og legg forsiktig til bunnlaget på 6-brønns kulturplaten (2 x 104 celler / ml).
- Plasser 6-brønns kulturplaten horisontalt på en flat overflate ved 4 °C i minst 15 minutter, slik at topplaget kan størkne.
- Etter at blandingen størkner, legg platen i en 37 ° C inkubator i en uke før du legger til fôringslaget.
4. Tilberedning av materlaget: 0,3% Agarose Gel
- Mikrobølgeovn den ferdiglagde 3% 2-Hydroxyethyl agarose oppløsningen i 15 sek. virvle forsiktig løsningen og mikrobølgeovnen i ytterligere 15 sek.
- Likevekt agaroseoppløsningsflasken i et 45 °C vannbad.
- Varm opp MCF10DCIS-mediet i et vannbad på 37 °C.
- Bland 1 ml 3% agaroseoppløsning med 9 ml varme MCF10DCIS-medier i et 50 ml konisk rør og inverter forsiktig for å blande agarose med media. Unngå å danne luftbobler.
- Behandle blandingen med BB-CLA (0 μM (DMSO) eller 1 μM).
- Tilsett forsiktig 1 ml av denne blandingen (uten å danne bobler) i hver brønn av den 6-brønns kulturplaten som inneholder de nederste og myke lagene.
- Plasser 6-brønns kulturplaten horisontalt på en flat overflate ved 4 °C i minst 15 minutter for å la blandingen størkne.
- Etter at materlaget størkner, plasser platen i en 37 °C inkubator.
- Gjenta denne fôringsprosedyren ukentlig ved å legge over 1 ml 0,3% agarose / medium / behandlingsløsning på det eksisterende materlaget for å fylle cellene med nye medier til kolonidannelse er observert.
MERK: Agar i de myke og materlagene er veldig myk, og derfor vil de tilsatte næringsstoffene fra materlaget lett spre seg inn i det celleholdige laget for å nå cellene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Zeiss Axiopot | Carl Zeiss Microscopy | 1021859251 | |
Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
DMEM/F-12 | Lonza BioWhittaker | 12-719F | |
HyClone Donor Equine Serum | Fisher Scientific | SH30074.03 | |
Penicillin Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
2-Hydroxyethylagarose: Type VII, low gelling temperature | Sigma-Aldrich | 39346-81-1 |