لينة أجار مستعمرة تشكيل المقايسة: طريقة لاختبار آثار المركبات الرواية على انتشار الخلايا السرطانية

1. إعداد 3٪ 2-هيدروكسي إيثيل أغاروز

1. في زجاجة نظيفة وجافة 100 مل، إضافة 0.9 غرام من 2-هيدروكسي إيثيل أجاروز (أغاروز السابع) تليها 30 مل من الماء المقطر.
2. ميكروويف الخليط لمدة 15 ثانية ودوامة بلطف. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات أخرى على الأقل حتى يذوب مسحوق الآغاروز تماما.
3. أوتوكلاف زجاجة تحتوي على حل لمدة 15 دقيقة.
4. السماح للحل agarose لتهدئة لRT قبل مزيد من الاستخدام. تخزين الحل في RT.

2. إعداد الطبقة السفلى: 0.6٪ Agarose جل

1. قبل الحارة عدة 5 مل و 10 مل ماصة في حاضنة 37 درجة مئوية لمنع agarose من ترسيخ في ماصة عند التعامل معها.
2. تخفيف جزئيا غطاء زجاجة والميكروويف الجاهزة 3٪ 2 هيدروكسي إيثيل agarose الحل لمدة 15 ثانية. ثم، دوامة بلطف الحل والميكروويف لمدة 15 ثانية أخرى.
   تحذير: كن حذرا عند تدوير حل agarose لأن الحل يرتفع عندما يتعرض للهواء ويمكن أن يمتد.
3. إذا كان هناك هلام الصلبة المتبقية في زجاجة، الميكروويف لبضع ثوان أخرى.
4. الحفاظ على زجاجة تحتوي على حل agarose في حمام الماء 45 درجة مئوية خلال الخطوات التالية لمنع الحل agarose من ترسيخ قبل الأوان.
5. وسائل الإعلام MCF10DCIS الدافئة في حمام مائي 37 درجة مئوية.
   ملاحظة: MCF10DCIS وسائل الإعلام يتكون من DMEM/F12، 5٪ مصل الحصان، 5٪ ستريبتوميسين البنسلين.
6. نقل 3 مل من محلول الآغاروز 3٪ باستخدام ماصة ماصة قبل تسخينها في أنبوب مخروطي معقم 50 مل.
7. إضافة فورا 12 مل من وسائل الإعلام MCF10DCIS الدافئة وعكس بلطف أنبوب مخروطي لخلط agarose مع وسائل الإعلام. حاول أن لا تشكل أي فقاعات لأنها سوف تتداخل مع العد مستعمرة في وقت لاحق.
8. إضافة بلطف 2 مل من هذا الخليط في كل بئر من لوحة ثقافة 6-جيدا دون تشكيل أي فقاعات الهواء.
9. احتضان لوحة الثقافة 6-جيدا أفقيا على سطح مستو في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة للسماح للخليط لترسيخ.
10. بعد أن يتماسك الخليط، ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الطبقة السفلية جاهزة الآن للاستخدام.

3. إعداد طبقة تحتوي على الخلية: 0.3٪ Agarose جل

1. جرب خلايا MCF10DCIS وتمييعها إلى تركيز خلية 4 × 10⁴ / مل.
2. خذ 2 مل من الآغاروز 3٪ باستخدام ماصة مسبقة الدفء ونقلها إلى أنبوب مخروطي معقم 50 مل.
3. إضافة فورا 8 مل من وسائل الإعلام MCF10DCIS إلى أنبوب مخروطي وعكس بلطف لخلط agarose مع وسائل الإعلام. تجنب تشكيل أي فقاعات.
4. تناول 2 مل من خلايا MCF10DCIS (4 × 10⁴ /مل) وتعامل مع BB-CLA (0 ميكرومتر (DMSO) أو 1 ميكرومتر).
5. في تخفيف 1:1، خلط الخلايا مع 0.6٪ agarose.
6. خذ 1 مل من خليط الخلايا-الآغاروز وأضف بلطف إلى الطبقة السفلية من لوحة الثقافة 6-well (2 × 10⁴ خلايا / مل).
7. ضع لوحة الثقافة ذات 6 آبار أفقيا على سطح مستو عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح للطبقة العليا بترسيخها.
8. بعد تماسك الخليط، ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة أسبوع قبل إضافة طبقة التغذية.

4. إعداد طبقة التغذية: 0.3٪ Agarose جل

1. الميكروويف الجاهزة 3٪ 2-هيدروكسيثيل agarose الحل لمدة 15 ثانية. دوامة بلطف الحل والميكروويف لمدة 15 ثانية أخرى.
2. توازن زجاجة الحل agarose في حمام مائي 45 درجة مئوية.
3. قم بتدفئة وسائط MCF10DCIS في حمام مائي 37 درجة مئوية.
4. مزيج 1 مل من محلول agarose 3٪ مع 9 مل من وسائل الإعلام MCF10DCIS الدافئة في أنبوب مخروطي 50 مل وعكس بلطف لخلط agarose مع وسائل الإعلام. تجنب تشكيل فقاعات الهواء.
5. علاج الخليط مع BB-CLA (0 ميكرومتر (DMSO) أو 1 ميكرومتر).
6. إضافة بلطف 1 مل من هذا الخليط (دون تشكيل فقاعات) في كل بئر من لوحة ثقافة 6-جيدا التي تحتوي على الطبقات السفلية والناعمة.
7. ضع لوحة الثقافة ذات 6 آبار أفقيا على سطح مستو عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح للخليط بترسيخه.
8. بعد أن تتماسك الطبقة المغذية، ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية.
9. كرر هذا الإجراء التغذية أسبوعيا عن طريق تراكب 1 مل من 0.3٪ agarose / متوسط / محلول العلاج على طبقة التغذية الموجودة لتجديد الخلايا مع وسائل الإعلام الجديدة حتى يتم ملاحظة تشكيل مستعمرة.
   ملاحظة: أغار في الطبقات الناعمة والمغذيات لينة جدا، وبالتالي، فإن المواد الغذائية المضافة من طبقة التغذية تنتشر بسهولة في طبقة تحتوي على الخلية للوصول إلى الخلايا.