Ortopinjektion: Implantera vävnadsspecifika cancerceller i en vuxen mus

1. Beredning av celler (för 10 möss)

OBS: Cellerna ska vaccinelas inom 1 timme efter att ha lossnat från skålen för att undvika minskad cell livskraft. Specifikt bör cellupphängningen blandas i den gelatinösa proteinblandningen inom 15 minuter efter att cellerna har lossats från skålen för att bibehålla deras livskraft.

1. Kultur 4T1-luc2 celler, en mus mammary adenocarcinom cellinje uttrycker luciferase, i RPMI 1640 media med 10% FBS i en fuktad inkubator vid 37 °C i 5% CO₂.
2. Tvätta de vidhäftande 4T1-luc2-cellerna i en 10 cm skål med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med en 10 ml serologisk pipett. Tillsätt 1 ml 0,25% trypsin med en P1000-pipett och inkubera sedan provet vid 37 °C i 5 minuter. Tillsätt sedan 4 ml tillväxtmedier (RPMI-1640 med 10% FBS) med en 5 ml serologisk pipett och överför cellupphängningen till ett 15 ml koniskt rör i en vävnadskulturhuv. Centrifugera cellfjädringen vid 180 x g i 5 min.
3. Aspirera supernatanten och återanvänd cellerna i 2 ml PBS; räkna sedan cellerna med hjälp av hemocytometern.
4. Suspendera 2 x 10⁶ 4T1-luc2 celler i 40 μL kall PBS (pH 7,4, 4 °C) i vävnadskulturens huva.
5. Blanda 40-μL-cellupphängningen med 360 μL av den gelatinösa proteinblandningen i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör på is i vävnadskulturens huva.
   OBS: Den slutliga koncentrationen är 1 x 10⁵/20 μL (1:9 PBS:gelatinös proteinblandning). För den ortopiska modellen (ingen mastektomi) användes 1 x 10⁴/20 μL av den slutliga koncentrationen, för att undvika att uppnå dödshjälpskriterier (tumörstorlek > 2 cm) inom två veckor.

2. Inokulering av cancerceller

1. Lägg mössen i anestesiinduktionskammaren med 2-4% isofluran och 0,2 L/min syreflöde tills mössen andas lugnt (2-3 min).
2. Ta tag i musen och injicera 0,05 mg/kg buprenorfin i axeln subkutant.
3. Bekräfta adekvat anestesi genom bristen på reaktion på en tå nypa. Sätt in musens näsa i musmaskens hål, vilket möjliggör inandningsbedövning med 2-4% isofluran och 2 L/ min syreflöde fäst vid en kolbehållare.
4. Håll tillbaka musens lemmar med labbtejp och sterilisera huden med klorhexidin, jod och 75% etanol med bomullspinne.
5. Gör ett 5 mm hudsnitt i mitten av den främre bröstväggen med steril mikrodissektionssax, lyft höger hud bredvid snittet och lossa huden från bröstväggen med hjälp av saxen och vänd sedan huden för att exponera rätt #2 bröstfettdyna.
6. Injicera försiktigt 20 μL cancercellsupphängning med en 1 ml insulinspruta med en 28,5 G nål i fettdynan under direkt syn genom såret.
   OBS: Nålen går genom såret, inte huden. Håll nålen i fettdynan i 5 s innan du drar ut den, vilket ger tid för den gelatinösa proteinblandningen att stelna.
7. Stäng hudsnitten genom att sy, använd sterila 5-0 icke-absorberbara suturer.
8. Efter operationen, återvänd djuren till en ren bur och övervaka dem tills de har återhämtat sig och rör sig fritt (efter ~ 1-2 min). Om ett djur inte verkar vara vid god hälsa inom 24 timmar efter operationen, administrera buprenorfin (0, 2 mg/kg).
9. Ta bort suturerna under anestesi (se steg 2.1) 7 d efter operationen.