Orthotopische Injektion: Implantation von gewebespezifischen Krebszellen in eine erwachsene Maus

1. Präparation von Zellen (für 10 Mäuse)

HINWEIS: Die Zellen sollten innerhalb von 1 h geimpft werden, nachdem sie von der Schale gelöst wurden, um eine verminderte Zelllebensfähigkeit zu vermeiden. Insbesondere sollte die Zellsuspension innerhalb von 15 min nach dem Ablösen der Zellen von der Schale in die gelatineartige Proteinmischung gemischt werden, um ihre Lebensfähigkeit zu erhalten.

1. Kultur 4T1-luc2-Zellen, eine Maus-Mamma-Adenokarzinom-Zelllinie, die Luziferase exdrückt, in RPMI 1640-Medien mit 10% FBS in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C bei 5%_CO2.
2. Waschen Sie die anhaftenden 4T1-luc2-Zellen in einer 10-cm-Schale mit phosphatgepufferter Saline (PBS) mit einer 10 ml serologischen Pipette. Fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin mit einer P1000 Pipette hinzu und inkubieren Sie die Probe dann bei 37 °C für 5 min. Fügen Sie dann 4 ml Wachstumsmedien (RPMI-1640 mit 10% FBS) mit einer 5 ml serologischen Pipette hinzu und übertragen Sie die Zellsuspension in eine 15-ml-Konustube in einer Gewebekulturhaube. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 180 x g für 5 min.
3. Aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 2 ml PBS; Zählen Sie dann die Zellen mit dem Hämozytometer.
4. Hängen Sie 2 x 10⁶ 4T1-luc2-Zellen in 40 l kalten PBS (pH 7,4, 4 °C) in der Gewebekulturhaube aus.
5. Mischen Sie die 40-L-Zellsuspension mit 360 l des gelatinösen Proteingemisches in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr auf Eis in der Gewebekulturhaube.
   HINWEIS: Die Endkonzentration beträgt 1 x 10⁵/20 l (1:9 PBS:gelatinöse Proteinmischung). Für das orthotopische Modell (keine Mastektomie) wurden 1 x 10⁴/20 l der Endkonzentration verwendet, um zu vermeiden, dass euthanasien -kriterien (Tumorgröße > 2 cm) innerhalb von zwei Wochen erreicht werden.

2. Krebszellimpfung

1. Setzen Sie die Mäuse in die Anästhesie-Induktionskammer mit 2-4% Isofluran und 0,2 l/min Sauerstofffluss, bis die Mäuse ruhig atmen (2–3 min).
2. Greifen Sie die Maus und injizieren 0,05 mg/kg Buprenorphin in seine Schulter subkutan.
3. Bestätigen Sie eine ausreichende Anästhesie durch das Fehlen einer Reaktion auf eine Zehenklemme. Setzen Sie die Nase der Maus in das Loch der Mausmaske ein, die eine inhalative Anästhesie mit 2-4% Isofluran und 2 L/min Sauerstofffluss ermöglicht, der an eine Holzkohlekanistereinheit angeschlossen ist.
4. Halten Sie die Gliedmaßen der Maus mit Laborband zurück und sterilisieren Sie ihre Haut mit Chlorhexidin, Jod und 75% Ethanol, mit Wattestäbchen.
5. Machen Sie einen 5 mm Hautschnitt in der Mitte der vorderen Brustwand mit steriler Mikrodissektionsschere, heben Sie die rechte Haut neben dem Schnitt und lösen Sie die Haut von der Brustwand mit der Schere, und dann, invertieren Sie die Haut, um die richtige #2 Brustfettpad freizulegen.
6. Mit einer 1 ml Insulinspritze mit einer 28,5 G Nadel in das Fettpolster unter direktem Sehen durch die Wunde spritzen Sie vorsichtig 20 l Krebszellsuspension.
   HINWEIS: Die Nadel geht durch die Wunde, nicht die Haut. Halten Sie die Nadel 5 s im Fettpolster, bevor Sie sie herausziehen, was Zeit für die Verfestigung der gelatinösen Proteinmischung lässt.
7. Schließen Sie die Hautschnitte durch Nähen, mit sterilen 5-0 nicht resorbierbaren Nähten.
8. Nach der Operation, kehren Sie die Tiere in einen sauberen Käfig zurück und überwachen Sie sie, bis sie sich erholt haben und sich frei bewegen (nach 1–2 min). Wenn ein Tier innerhalb von 24 h nach einer Operation nicht in guter Gesundheit zu sein scheint, verabreichen Sie Buprenorphin (0,2 mg/kg).
9. Entfernen Sie die Nähte unter Anästhesie (siehe Schritt 2.1) 7 d nach der Operation.