توضح هذه المقالة على بروتوكول لاستخراج ترجمة ريبوسوم من خلايا حقيقية النواة. استخراج مرة واحدة ، يتم فصلها في ريبوسوم monosomes وpolyribosomes بواسطة تجزيء التدرج السكروز للسماح بتحليل السكان الريباسي مختلفة. على هذا النحو ، فإن هذا الأسلوب هو معيار الذهب لدراسة تنظيم الترجمة.
تخليق البروتين هو عملية معقدة الخلوية التي تنظم في العديد من المستويات. على سبيل المثال ، يمكن أن تحول دون الترجمة العالمي في مرحلة بدء المرحلة استطالة أو من جانب مجموعة متنوعة من الضغوط الخلوية مثل المجاعة الأحماض الأمينية أو النمو الانسحاب عامل. بدلا من ذلك ، يمكن أن ينظم ترجمة mRNAs الفردية عن طريق توطين مرنا أو وجود microRNAs وما شابه ذلك. دراسات لتصنيع البروتين في كثير من الأحيان استخدام تحليل polyribosome لتسليط الضوء على آليات التنظيم الترجمة أو عيوب في تخليق البروتين. في هذا الاختبار ، يتم عزل مرنا / المجمعات الريبوسوم من خلايا حقيقية النواة. التدرج الكثافة السكروز يفصل mRNAs منضمة إلى ريبوسوم متعددة المعروفة باسم polyribosomes من mRNAs منضم إلى الريبوسوم واحد أو monosome. تجزيء من التدرجات يسمح العزلة والكمي للسكان الريباسي المختلفة والمرتبطة بها أو mRNAs البروتينات. يمكن الاختلاف في نسبة polyribosomes لmonosomes في ظل ظروف محددة يكون مؤشرا على بدء عيوب في الترجمة أو استطالة / الإنهاء. ويمكن النظر في mRNAs موجودة في الكسور polyribosome تكشف ما إذا كان فوج من mRNAs الفردية يترجم التغييرات مع الظروف التجريبية. بالإضافة ، يمكن رصد التجمع الريبوسوم من خلال تحليل قمم الوحيدات الريباسي الصغيرة والكبيرة التي يتم فصلها أيضا عن طريق التدرج. في هذا الفيديو ، نقدم طريقة لإعداد مقتطفات الريباسي الخام من خلايا الخميرة ، وفصل من مستخلص بواسطة التدرج السكروز وتفسير النتائج. هذا الإجراء هو قابلية للتكيف مع خلايا الثدييات.
يمكن الحصول على المعلومات من التشكيل polyribosome توفير معلومات قيمة حول حالة متعدية للخلية. بالإضافة ، يمكن تحديد حالة تجميع مفارز الريباسي أنفسهم 2. على سبيل المثال وجود halfmers أو 80S وأكبر قمم مع الكتف طفيفة إلى اليمين على ملف يشير إلى الالتزام الوحيدات 40S 60S الوحيدات تنتظر الانضمام. تنفيذ التجربة في ظل غياب أي سيكلوهيكسيميد المضافة أو غيرها من مثبطات استطالة يسمح للتحليل في معدل الجريان السطحي ، الذي يشير إلى ما إذا كانت أو لم يتم تبديل استطالة 3. الكسور هي نفسها مصدرا غنيا من الكواشف لقرار لاحق للجمعية من بروتين معين أو مرنا مع المجموعات السكانية الفرعية التي الريباسي النشاف أو الشمالية الغربية من الكسور. يمكن تحديد تجمع مجموعه mRNAs المرتبطة ريبوسوم النشطة عبر ميكروأري المرتبطة 4 أو 5 العميق تحليل التسلسل. كما يمكن للجمعيات أن يستقر البروتين بإضافة المناسبة لربط عبر كاشف 6.
تحليل Polyribosome من خلايا الثدييات الجدير بالذكر كبروتوكول متميزة من حيث الصعوبات الواضحة في تهيئة الظروف اللازمة للحصول على polysomes مستقرة. نظم العازلة التي أعلن عنها في الأدبيات هي متغير على نطاق واسع 70-10 ، وبالتالي قد يكون هناك شرط لخلية من نوع التحسين المحددة للتحلل العازلة ، أو أنه أمر وارد أيضا أن نظام المخزن ليس مهما بقدر الاهتمام حريصة على العمل مع أبقى lysates جديدة في درجات حرارة منخفضة. على حد علمنا لم يتم إجراء تقييم منهجي من المعلمات التي تؤثر على تشكيل polysome الثدييات عنها.
The authors have nothing to disclose.
الكتاب أود أن أنوه لجون Woolford الأساس الأولي لهذا الأسلوب ، يتم اعتماد TGK المعاهد الوطنية للصحة وGM057483 AI076245 ومعتمد من قبل لجان المقاومة الشعبية GM77073.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
polyallomer ultracentrifuge tube | Beckman | 326823 | 1 x 3.5 in. (25x89mm) | |
Fluorinert | Sigma | F9755 | ||
Cycloheximde | Sigma | C-7698 | ||
Heparin | Sigma | H3393 | ||
BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 | Other strains work equally well |