האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח

1. הכנת הדרגתיים סוכרוז 7-47% הכן הדרגתיים סוכרוז יום אחד לפני השימוש כדי לאפשר הדרגתיים להיות רציפה. בצע סטרילי 7% ופתרונות סוכרוז 47% המכיל 50mm NH 4 Cl, 7.0-50mm טריס pH Acetate ו 12mm MgCl 2 ולאחסן ב 4 ° C 1. במשך 6 הדרגתיים לערבב את 7% ו -47% מניות פתרונות סוכרוז לעשות 48 מ"ל של כל אחד ריכוזי סוכרוז הבאה. הוסף DTT (1M המלאי) לפתרון כל סוכרוז לריכוז סופי של 1 מ"מ. הריכוז הסופי 7% סוכרוז 47% סוכרוז 7% 48 מ"ל 0 17% 36 מ"ל 12 מ"ל 27% 24 מ"ל 24 מ"ל 37% 12 מ"ל 36 מ"ל 47% 0 48 מ"ל על מנת לשפוך את הדרגתיים, לצרף פיפטה פסטר כדי מזרק 20 מ"ל ידי הבטחת ואיטום עם Parafilm או להשתמש מחט ארוכה. הוסף 7 מ"ל של סוכרוז 7% אל החלק התחתון של 1 x 3.5 צינור "ultracentrifuge polyallomer. הבא להוסיף 7 מ"ל של תמיסת סוכרוז 17% תחת הפתרון של 7% על ידי הנחת קצה פיפטה פסטר קרוב לתחתית של צינור pipetting לא יותר מהר מאשר 0.3 mL / sec. חזור עם 7 מ"ל כל אחד 27%, 37% ו 47% סוכרוז פתרונות. אתה צריך לשמור קווים ברורים בין השכבות, המציין כי ערבוב מינימלי התרחשה. Store הדרגתיים ב 4 ° C למשך הלילה יחד עם הרוטורים, בקבוקים צינורות אשר ישמשו לקצור דגימות. 2. הכנת תמצית שמרים לגדול 125 מ"ל של התרבות השמרים כדי OD של 600 0.8-1.0. הוסף cycloheximide לתרבות לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ולהמשיך רועד ב 30 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. בינתיים, להכין מאגר תמוגה המכיל 80 מיקרוגרם / מ"ל cycloheximide, 200 מיקרוגרם / מ"ל הפרין, DEPC 0.2%, ו 10 mM טריס-HCl pH 7.5, 0.1M NaCl, 30mm MgCl 2. שמור הכל על קרח מנקודה זו ואילך. יוצקים את התרבות לתוך בקבוק 250 מ"ל צנטריפוגות ולמלא עם קרח. צנטריפוגה XG ב 8000 (7,250 סל"ד ב הרוטור SLA-1500) עבור 5 דקות ב 4 ° C. שטפו את הכדור פעם אחת עם 10 מ"ל של חיץ קרים תמוגה ולהעביר צינורות פוליפרופילן 15 מ"ל. צנטריפוגה XG ב 5900 (~ 6000 סל"ד הרוטור ב-SLA 600TC א) 3 דקות ב 4 ° C. Resuspend את הכדור בתוך 0.5 מ"ל של העברת חיץ, תמוגה אל צינור 1.5mL ומוסיפים 0.5 מ"ל של צונן, חומצה שטף חרוזי זכוכית אפוי. וורטקס התאים ארבע במרווחים 30 שניות, קירור הצינור על קרח למשך 30 שניות בין כל מרווח. הוסף 0.5 מ"ל של חיץ תמוגה לתוך צינור 1.5 מ"ל. צנטריפוגה במהירות המרבית microcentrifuge (14,000 סל"ד ב microcentrifuge Eppendorf 5417R) במשך 10 דקות ב 4 ° C. העברת supernatant על צינור חדש microcentrifuge 1.5 מ"ל. הסר 10 μl לצינור נפרד כדי לקבוע את 260 / OD OD 280 יחס (ראה שלב 3.1 להלן). חנות תמציות ב -80 ° C. 3. הכנת תמצית בתאי יונקים עבור תאים חסיד, לגדול צלחת 100 מ"מ עד מפגש ~ 70%. אתה צריך אחד צלחת 100 מ"מ לכל שיפוע מ"ל 11 (תשואה הטיפוסי הוא ~ 20 OD 260 יחידות). סולם סכום ליניארי עבור גדלים שיפוע גדול או קטן. עבור לא חסיד תאים, כ 1 x 10 7 תאים יש צורך לכל צבע 11 מ"ל. לפני תמוגה, להוסיף cycloheximide עד 100 מיקרוגרם / מ"ל. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. העברת צלחות קרח ולשטוף תאים פעמיים קרים PBS. כל צעדים בעתיד חייב להתבצע בבית 0-4 ° C. הסר את כל עקבות של PBS על ידי שאיפה (שלא צלחות ניקוז על המיטה בזווית של קרח) ולהוסיף 1 מ"ל תמוגה חיץ, לגרד ולהעביר צינור 1.5 מראש צונן מ"ל. חיץ רכיבים תמוגה יהיה צריך להיות מותאם לסוג תא ותנאי הגידול. חיץ התחלה טובה תהיה 20 מ"מ HEPES-KOH, pH 7.4, 15 מ"מ MgCl 2, 200 מ"מ KCl, 1% טריטון X-100 (v / v), 100 מיקרוגרם / מ"ל cycloheximide, 2 מ"מ DTT, ו 1 מ"ג / מ"ל הפרין. המשתנים העיקריים הם הריכוזים של מגנזיום אשלגן כלורי וכן הכללת או הרחקה של דטרגנטים יוניים אי – כדי לשפר את מיצוי של polysomes מחויב cytoskeletal או קרום. Lyse תאים על ידי עובר דרך מחט מזרק 27 מד פעמיים או שבץ 5-10 של homogenization dounce באמצעות סוג B העלי. מזרק או homogenizer צריך להיות מקורר מראש לפני השימוש. ספין על XG 14,000 עבור 5 דקות בתוך microcentrifuge בקירור. העברת lysate טריים השיפוע סוכרוז (עבור בתאי יונקים זה מורכב במאגר תמוגה חסר טריטון X-100 ו – הפרין אבל חוץ מזה כמתואר 1.2 ו -1.3) או הקפאה בחנקן נוזלי פלאש לשימוש מאוחר יותר. </ol> 4. צנטריפוגה של הדרגתיים הפשירי lysates polyribosome על הקרח. קבע את הריכוז של חומצות גרעין ב lysate על ידי הוספת המדגם 10 μL שמורות ל 1 מ"ל מים לקרוא את 260 / OD OD 280 יחס עם ספקטרופוטומטר. תשואה אופיינית מתרבות שמרים גדל כמתואר היא 50 יחידות OD. בעזרת פיפטה עם קצה להציב על הקיר של הצינור סמוך לפני השטח של השיפוע, בעדינות שכבה 25 OD 260 יחידות של lysate על גבי השיפוע. במשך 35 מ"ל 500 μl שיפוע של lysate נטען בדרך כלל. חיץ תמוגה ניתן להשתמש כדי להבטיח את כל הדרגתיים נטענים עם נפח שווה. כמויות נמוכות של החומר להניב החלטה טובה יותר. בעזרת מלקחיים, בזהירות להוריד את הדרגתיים לסלים של הרוטור דלי מתנדנד. צנטריפוגה הדרגתיים ב XG 100,000 (23,000 סל"ד ב רוטור Surespin 630) עבור 4 שעות ב 4 ° C. פרוטוקול זה יכול להיות מותאמים עבור הדרגתיים נפח קטן יותר. 5. אוסף של נתונים שברים כ 30 דקות לפני השלמת הסיבוב 4 שעות לצרף את המחט על מדקר צינור דגם 184. צרף את העט דגם Isco באינטרנט UA-5 ספיגת / Monitor פלואורסצנטי. כוח על ספיגת לפקח לאפשר בסיס יציב כדי להגיע לפני ניתוח דגימות. רכישת אלקטרונית של הפרופיל polysome יכול בקלות להיות מתקבל על ידי הצמדת DI-148U נתונים יחידה הרכישה (DATAQ מכשירים) כדי מקליט את התרשים. פרופילים אז יכול להיות בזמן אמת שנאספו ונשמרו במשך ביאור מאוחר יותר באמצעות תוכנת WinDaq הנלווים. מלאו את משאבת מזרק עם 50 מ"ל של Fluorinert באמצעות זרימה הפוכה, הגדרה מהירה. ודא שאין בועות אוויר הנוכחי. חבר את הצינור מזרק כדי דוקרת את הצינור בקצרה להפעיל זרימת Fluorinert ב 3 מ"ל / דקה לכיוון קדימה כדי לנקות את הצינור של כל בועות האוויר. מניחים כוס פסולת או סדרה של צינורות אם איסוף שברים תחת הצינור בסוף התא זרימה לאסוף מדגם לברוח. הסר בזהירות את צנטריפוגה polyallomer צינורות המכילים את שיפוע סוכרוז מן הרוטור צנטריפוגות ומניחים אותם על הקרח (טרום בצורת בארות הקרח עם שפופרת ריק, כדי למנוע הדרגתיים מטריד). כדי לנתח תמציות התא, במקום צינור מפל על מדקר את הצינורית. חבר את החלק העליון של הצינור לשקע ומאובטח. הרם את השלב התחתון הצינור צנטריפוגות כך המחט חודרת את החלק התחתון של הצינור. לאחר המחט יש שבלט דרך התחתון של הצינור צנטריפוגות, להתחיל את זרימת Fluorinert בכיוון קדימה 6mL/min. לאחר Fluorinert החלה לזרום לתוך הצינור, לנטר את התנועה של המחט על צג ספיגת באינטרנט. פעם מחט מתחיל לנוע, להפעיל את תנועת תרשים להגדרה מהירות 60. הצג יתעד את OD 254 החל החומר ואחריו חינם לגילוי ה -40 למקטע ריבוזומלי והמשך דרך מתחמי polyribosome. אם אתה איסוף שברים של רנ"א או ניתוח חלבון, בדרך כלל 0.2 שברים דקות נלקחים (1 מ"ל). לניתוח RNA, שברים יש לאסוף ישירות לתוך צינורות המכיל Trizol (Invitrogen), פנול או SDS / proteinase K, בהתאם לשיטה המועדפת של מיצוי. כאשר בסופו של הפרופיל polyribosome הושג, לכבות את זרימת Fluorinert אל הצינור צנטריפוגות ולעצור את התנועה תרשים של ספיגת / לפקח פלואורסצנטי. לסגת Fluorinert מהצינור צנטריפוגות לתוך המזרק עד תחילת הזרימה בכיוון ההפוך בקצב מהיר לוודא שלא למשוך סוכרוז מהצינור לתוך המזרק. פרקו את הצינור מתוך צנטריפוגה דוקרת את הצינור, להנמיך את המחט, ולהסיר את הצינור. חזור על שלבים 5.5 עד 5.8 עבור כל שיפוע סוכרוז. כאשר כל הדרגתיים סוכרוז כבר ניתחו, לסגת Fluorinert מצינור חזרה לתוך המזרק. הסר כל חלק fractionator (מקב הצינורית של התא זרימה) כולל צינור הפסולת הממוקם בראש ולשטוף היטב עם מים. 6. נציג תוצאות באיור 1. עקבות נציג של לחלץ הריבוזום שהוכן זן שמרים BY4741 (מחצלת his3 Δ Δ leu2 1 0 0 ura3 met15 Δ Δ 0) בנוכחות cycloheximide. תמצית ריבוזומלי היה לפרק ניצול שיפוע 7 סוכרוז 47% ונותחו באמצעות מזרק משאבה מתקן המחובר גלאי UV. פיקס המכיל polyribosomes וה -80, ה -60 וה -40 ריבוזומים מסומנים.