真核Polyribosome剖面分析

1。 7-47％蔗糖梯度制备准备蔗糖梯度有一天，在使用之前，让渐变成为连续。无菌7％和47％的蔗糖溶液，含50mm 的NH 4 CL，50毫米的Tris -醋酸的pH 值 7.0和12mm MgCl 2的和储存在4 ° C 1。 6梯度组合的7％和47％蔗糖的股票解决方案，使48毫升以下的蔗糖浓度。数码地面电视（1M股票）添加到每个蔗糖溶液至终浓度为1mm。 终浓度 7％的蔗糖 47％的蔗糖 7％ 48毫升 0 17％ 36毫升 12毫升 27％ 24毫升 24毫升 37％ 12毫升 36毫升 47％ 0 48毫升为了倒梯度，巴斯德吸管附加保障，并用封口膜密封，20毫升注射器或使用长针。 7％的蔗糖添加7毫升1 × 3.5“polyallomer超速离心机试管底部，然后添加7毫升17％，7％的解决方案下的蔗糖溶液，放置巴斯德吸管试管的底部附近的一角，超过0.3吹打没有更快毫升/秒7毫升的27％，37％和47％的蔗糖溶液的重复，您应遵守线条清晰，层与层之间，最小的混合。商店梯度发生在4 ° C过夜连同转子，瓶将用于收获样品管。 2。酵母提取物的制备增长酵母培养125毫升0.8-1.0外径600。添加酮的文化到终浓度为100微克/毫升，并继续摇动30 ° 15分钟的彗星。 同时，准备裂解液中含有80微克/毫升放线菌酮，200微克/ ml肝素，0.2％DEPC，和10毫米的Tris – HCl pH值7.5，0.1M的氯化钠，氯化镁30MM 2。保持冰从这个角度上的一切。 倒入一个250毫升离心瓶的文化，并填补了冰。在8000 XG（7250 RPM在SLA – 1500转子）离心5分钟在4 ° C洗涤沉淀一次用10毫升的冰冷的裂解液转移至15 mL聚丙烯管。在5900 XG（〜6000 RPM）在一个SLA – 600TC转子离心3分钟，在4 ° C重悬在0.5 mL裂解缓冲液，转移中的颗粒1.5ml离心管，加入0.5毫升冷冻，烘烤，酸洗玻璃珠。涡4个30秒的间隔，在冰上冷却管，相互之间间隔为30秒的细胞。添加到另一个裂解液0.5毫升1.5毫升管。在微量的Eppendorf 5417R离心（14,000 RPM）的最大速度离心10分钟在4 ° C上清转移到一个新的1.5 ml离心管。取出10μL到一个单独的管，以确定的OD 260 / OD 280比值（见下文步骤3.1）。商店提取物在-80 ° C 3。从哺乳动物细胞提取物的制备对于贴壁细胞，生长在100毫米的菜〜70％汇合。您将需要一个100毫米，每11毫升梯度菜（典型的产量是20 OD 260单位） 。金额较大或较小的梯度大小线性的规模。对于非贴壁细胞，约1 × 10 7细胞都需要每11毫升梯度。 裂解之前，添加100μg/ mL的放线菌酮。在37 ° C下15分钟。传输板冰，在冰冷的PBS冲洗细胞两次。将来所有的步骤必须进行在0-4 ° C。 的PBS吸删除所有痕迹（让板漏角度的冰床），并添加1 mL裂解缓冲液，刮去，并转移到预冷1.5 mL试管。裂解液成分，将需要的细胞类型和生长条件进行了优化。一个很好的起点缓冲区将20毫米的HEPES – KOH，pH值7.4，15毫米氯化镁2，氯化钾200毫米，1％海卫X – 100（V / V），100微克/毫升放线菌酮，2毫米的数码地面电视服务，和1 mg / ml肝素。的关键变量，镁和氯化钾，以及列入或排除非离子型洗涤剂，以提高提取的骨架或膜约束polysom​​es的浓度。通过两次通过27号注射器针头或5-10 dounce同质化的招用B型杵裂解细胞。应预冷前使用的注射器或匀浆。 冷冻离心5分钟旋转14000 XG。将新鲜的裂解蔗糖梯度（哺乳动物细胞裂解缺乏Triton X – 100和肝素的缓冲，但在1.2和1.3所述，否则）或闪光灯以备后用液氮冻结。 </ol> 4。渐变离心效果在冰上解冻polyribosome裂解液。保留10μL样品中加入1毫升水，并用分光光度计读取OD 260 / OD 280的比例确定核酸裂解液浓度。从酵母培养成长为描述一个典型的产量是50外径为单位。 使用吸管尖端放在对管梯度表面附近的墙壁，轻轻层25 外径 260梯度顶部裂解单位。对于一个35 mL的梯度500μL裂解液通常是加载。可用于裂解缓冲液，以保证所有的梯度与同等体积加载。较低的数额的物质会产生更好的分辨率。使用镊子，小心地降低到一个水平转头桶的梯度。 梯度离心4小时100000 XG在Surespin 630转子（23,000 RPM）在4 ° C。该协议可以适用于更小的体积的梯度。 5。收集的数据和分数大约30分钟前完成4小时旋转针型号184管穿孔。将笔到网上ISCO型号UA – 5吸光度/荧光显示器。对吸光度的电源监控，以便分析样品前，要达到一个稳定的基准。电子收购的polysom​​e轮廓，可以很容易地获得通过附加一个DI – 148U的数据采集单元（DATAQ仪器）图表记录。配置文件可以实时收集和保存以供日​​后使用附带的WinDaq软件的注释。 填充Fluorinert使用的逆向流动，迅速设置50毫升的注射泵。确保有没有气泡。从注射器管穿孔的软管连接，并暂时关闭3毫升/分钟的前进方向，以清除任何气泡软管Fluorinert流。 放置一个废物管或烧杯系列如果收集馏分流动池下软管收集样品运行。 小心取出polyallomer离心管中，含有蔗糖梯度离心转子，放在冰（前形成与冰空管的井，以避免干扰梯度）。 为了分析细胞提取物，梯度管，管穿孔。管上方连接到电源插座和安全。提高阶段性底部的离心管，使针头穿透试管底部。一旦针头通过离心管底部的突出的前进方向，开始在6mL/min流Fluorinert。 一旦Fluorinert已经开始流入管，监察运动的针上在线吸光度监测。一旦针开始移动，在图表上的运动，以60的速度设定。监视器将记录与40S核糖体亚基检测，并继续通过polyribosome络合物自由材料的外径254起。如果你正在收集RNA或蛋白质分析的分数，通常是0.2分的分数是（1毫升）。 RNA分析，分数应该是直接收集到含有Trizol试剂（Invitrogen公司），苯酚或SDS /蛋白酶K管上的首选方法提取而定。 当年底的polyribosome轮廓已经达成，关闭流Fluorinert离心管和停止的吸光度/荧光显示器中的图表运动。 缩回到注射器Fluorinert开始在相反的方向流动快速，请务必不要从蔗糖进入注射器管率从离心管。拧开管穿孔的离心管中，低针，取出管。 重复步骤5.8 5.5每个蔗糖梯度。 当所有的蔗糖梯度进行了分析，收回Fluorinert从软管进入注射器。删除每个分馏部分，包括在上方废物软管（管穿孔和流动池），并用清水冲洗干净。 6。代表性的成果 图1代表核糖体中提取的痕迹的酵母菌株BY4741中存在的放线菌酮（垫HIS3ΔLEU2Δ0 met15ΔΔ0 0 URA3）的准备。核糖体的提取物被分割利用7 47％的蔗糖梯度和分析，使用一台泵注射器仪器连接到紫外探测器。含有多聚核糖体80S，60S和40S核糖体的峰表示。