Este protocolo establece métodos para extraer y cuantificar las respuestas a la feromona sexual volátil en C. elegans, proporcionando herramientas para estudiar la comunicación química y la trayectoria de navegación.
La comunicación química es vital para la salud del organismo, la reproducción y el bienestar general. La comprensión de las vías moleculares, los procesos neuronales y los cálculos que gobiernan estas señales sigue siendo un área activa de investigación. El nematodo Caenorhabditis elegans proporciona un poderoso modelo para estudiar estos procesos, ya que produce una feromona sexual volátil. Esta feromona es sintetizada por hembras vírgenes o hermafroditas sin esperma y sirve como atrayente para los machos.
Este protocolo describe un método detallado para aislar la feromona sexual volátil de varias cepas de C. elegans (cepa WT N2, daf-22 y fog-2) y C. remanei. También proporcionamos un protocolo para cuantificar la respuesta de la quimiotaxis masculina a la feromona sexual volátil. Nuestro análisis utiliza mediciones como el índice de quimiotaxis (CI), el tiempo de llegada (A.T.) y un gráfico de trayectoria para comparar con precisión las respuestas masculinas en diversas condiciones. Este método permite realizar comparaciones sólidas entre machos de diferentes orígenes genéticos o etapas de desarrollo. Además, la configuración experimental descrita aquí es adaptable a la investigación de otros productos químicos de quimioatracción.
La interacción entre la comunicación química y el éxito reproductivo es un principio fundamental en todo el reino animal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Las feromonas sexuales desencadenan una amplia gama de comportamientos sexualmente dimórficos esenciales para localizar parejas, coordinar los pasos necesarios para encontrar y atraer a una pareja y, en última instancia, promover la propagación de una especie 11,12,13,14,15,16,17. Se han logrado avances significativos en la comprensión de la señalización de feromonas, pero los mecanismos moleculares, los circuitos neuronales y los procesos computacionales que gobiernan estas interacciones a menudo permanecen incompletamente definidos 18,19,20,21,22,23,24,25,26.
El nematodo Caenorhabditis elegans proporciona un poderoso modelo para diseccionar estas preguntas. En particular, C. elegans exhibe una estrategia reproductiva inusual: los hermafroditas pueden autofertilizarse, pero también cruzarse con los machos 27,28,29,30,31,32,33. Esta flexibilidad requiere un sistema de comunicación robusto para señalar el estado reproductivo. C. elegans es conocido por sus feromonas solubles en agua bien caracterizadas, los ascarósidos, que desempeñan diversas funciones en el desarrollo, el comportamiento y las interacciones sociales. Descubrimientos recientes han revelado una clase distinta de feromonas sexuales volátiles empleadas por los nematodos. Estas feromonas son producidas específicamente por hembras vírgenes de C. elegans y C. remanei sexualmente maduras y hermafroditas sin esperma, sirviendo como atrayente para los machos adultos 29,34,35. Este atrayente exhibe un notable dimorfismo sexual en su producción y percepción. La gónada somática femenina gobierna la síntesis de esta feromona sexual volátil, y la producción refleja dinámicamente el estado reproductivo, cesando al aparearse y reanudándose varias horas después29,34.
La comprensión de la comunicación de las feromonas sexuales de los nematodos proporciona información sobre la evolución de los sistemas de comunicación química, la interacción entre el estado reproductivo y el comportamiento, y los mecanismos subyacentes al procesamiento neuronal sexualmente dimórfico 24,26,36,37,38,39 . Los estudios implican a la neurona anfiforme AWA en los hombres como crítica para la detección de feromonas, con el receptor SRD-1 acoplado a la proteína G desempeñando un papel clave en la detección de feromonas en los hombres24. C. elegans es muy adecuado para estudiar la comunicación química de los animales, especialmente la señalización de feromonas sexuales, debido a su dependencia del sistema olfativo para la búsqueda de pareja. Si bien se sabe mucho sobre la señalización de ascarósido, el sistema de feromonas sexuales volátiles ofrece oportunidades únicas para la comparación 25,26,36,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,
51,52,53,54,55,56,57. Además, C. elegans es un poderoso organismo modelo genético debido a su genoma completamente secuenciado, su linaje celular claramente definido y sus mutantes olfativos bien caracterizados.
Sin embargo, los circuitos neuronales completos involucrados en el procesamiento de esta feromona, los cálculos que traducen su percepción en comportamientos específicos de búsqueda de pareja y su regulación de biosíntesis aún no se han dilucidado por completo. Las investigaciones adicionales sobre estos procesos son cruciales para comprender los diversos mecanismos que gobiernan la comunicación y los comportamientos reproductivos de los animales. La identificación de genes clave implicados en la síntesis, secreción y percepción de feromonas promete desvelar nuevos actores moleculares en la comunicación animal. Los ensayos descritos aquí proporcionan una base para abordar estas preguntas.
Este protocolo proporciona una metodología robusta para la extracción de feromonas sexuales volátiles de C. elegans, junto con el establecimiento de un ensayo de quimioatracción robusto para medir las respuestas de quimioatracción masculina. Se puede encontrar información adicional en la guía del usuario de WormLab (consulte la Tabla de materiales); Para obtener un código básico para visualizar la trayectoria del movimiento del gusano, consulte la secci…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos al Dr. Tingtao Zhou por diseñar y escribir el código para las visualizaciones de trayectorias utilizadas en nuestro análisis. Este trabajo contó con el apoyo financiero de R01 NS113119 (PWS), la beca postdoctoral senior Chen y el Instituto de Neurociencia de Tianqiao y Chrissy Chen.
10 cm Petri dishes | Falcon | 25373-100 | Falcon bacteriological Petri dish 100 x 15 mm |
6 cm Petri dishes | Falcon | 25373-085 | Falcon bacteriological Petri dish 60 x 15 mm |
C. remanei (EM464) | CGC | ||
Centrifuge | Eppendorf | centrifuge 5418 | Any brand should work. |
Chemoattraction assay plates | Homemade solution | N/A | 1.5% agar, 25 mM NaCl, 1.5 mM Tris-base, and 3.5 mM Tris-Cl |
Cholesterol | Alfa Aesar | 57-88-5 | |
Dissecting Microscope | Leica | LeicaMZ75 | Any brand should work. |
E. Coli OP50 | CGC | ||
Ethanol | Koptec | 64-17-5 | |
fog-2(q71) (JK574) | CGC | ||
him-5(e1490)(CB4088) | CGC | ||
Household bleach | Clorox Germicidal bleach concentrated | Bleach | |
M9 buffer | Homemade solution | N/A | 3 g KH2PO4, 11.3 g Na2HPO4.7H2O, 5 g NaCl, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Add 1 mL 1 M MgSO4 after cool down to room temperature. |
Magnesium Sulfate, Anhydrous, Powder | Macron | M1063-500GM-EA | |
Microwave | TOSHIBA | N/A | Any brand should work. |
N2 | CGC | ||
NaOH | Sigma-aldrich | S318-3 | 1 M |
NGM plates solution | Homemade solution | N/A | 2.5 g Peptone, 18 g agar, 3 g NaCl, H2O to 1 L.Sterilize by autoclaving. Once the autoclave is done (2 h), wait until the temperature of the medium drops to 65 °C. Put on a hotplate at 65 °C and stir. Then add the following, waiting 5 min between each to avoid crystallization: 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL K3PO4 (1 M, pH=6), 1 mL Cholesterol ( 5 mg/mL in ethanol). |
Parafilm | Bemis | 13-374-10 | Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film |
Peptone | VWR | 97063-324 | |
Pipet- aid | Drummond Scientific | 4-000-100 | Any brand should work. |
Plastic paper | Octago | Waterproof Screen Printing Inkjet Transparency Film | https://www.amazon.com/Octago-Waterproof-Transparency-Printing-Printers/dp/B08HJQWFGD |
Potassium chloride | Sigma-aldrich | SLBP2366V | |
Potassium phosphate | Spectrum | 7778-77-0 | |
Pipette | Eppendorf | SKU: EPPR4331; MFG#: 2231300006 | 20 – 200 µL, 100 – 1000 µL, any brand should work. |
Rotator | Labnet | SKU: LI-H5500 | Labnet H5500 Mini LabRoller with Dual Direction Rotator. Any brand should work. |
Sodium chloride | VWR | 7647-14-5 | |
sodium phosphate dibasic | Sigma-aldrich | SLCG3888 | |
Tris-base | Sigma-aldrich | 77-86-1 | |
Tris-Cl | Roche | 1185-53-1 | |
Tryptone | VWR | 97063-390 | |
Vortex | Scientific industries | Vortex-Genie 2 | Any brand should work. |
WormLab system | MBF Bioscience | N/A | https://www.mbfbioscience.com/help/WormLab/Content/home.htm; https://www.mbfbioscience.com/products/wormlab/ |
Wormpicker | Homemade | N/A | made with platinum and glass pipet tips |