Summary

Extracción de feromonas sexuales volátiles y ensayo de quimioatracción en Caenorhabditis elegans

Published: August 09, 2024
doi:

Summary

Este protocolo establece métodos para extraer y cuantificar las respuestas a la feromona sexual volátil en C. elegans, proporcionando herramientas para estudiar la comunicación química y la trayectoria de navegación.

Abstract

La comunicación química es vital para la salud del organismo, la reproducción y el bienestar general. La comprensión de las vías moleculares, los procesos neuronales y los cálculos que gobiernan estas señales sigue siendo un área activa de investigación. El nematodo Caenorhabditis elegans proporciona un poderoso modelo para estudiar estos procesos, ya que produce una feromona sexual volátil. Esta feromona es sintetizada por hembras vírgenes o hermafroditas sin esperma y sirve como atrayente para los machos.

Este protocolo describe un método detallado para aislar la feromona sexual volátil de varias cepas de C. elegans (cepa WT N2, daf-22 y fog-2) y C. remanei. También proporcionamos un protocolo para cuantificar la respuesta de la quimiotaxis masculina a la feromona sexual volátil. Nuestro análisis utiliza mediciones como el índice de quimiotaxis (CI), el tiempo de llegada (A.T.) y un gráfico de trayectoria para comparar con precisión las respuestas masculinas en diversas condiciones. Este método permite realizar comparaciones sólidas entre machos de diferentes orígenes genéticos o etapas de desarrollo. Además, la configuración experimental descrita aquí es adaptable a la investigación de otros productos químicos de quimioatracción.

Introduction

La interacción entre la comunicación química y el éxito reproductivo es un principio fundamental en todo el reino animal 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Las feromonas sexuales desencadenan una amplia gama de comportamientos sexualmente dimórficos esenciales para localizar parejas, coordinar los pasos necesarios para encontrar y atraer a una pareja y, en última instancia, promover la propagación de una especie 11,12,13,14,15,16,17. Se han logrado avances significativos en la comprensión de la señalización de feromonas, pero los mecanismos moleculares, los circuitos neuronales y los procesos computacionales que gobiernan estas interacciones a menudo permanecen incompletamente definidos 18,19,20,21,22,23,24,25,26.

El nematodo Caenorhabditis elegans proporciona un poderoso modelo para diseccionar estas preguntas. En particular, C. elegans exhibe una estrategia reproductiva inusual: los hermafroditas pueden autofertilizarse, pero también cruzarse con los machos 27,28,29,30,31,32,33. Esta flexibilidad requiere un sistema de comunicación robusto para señalar el estado reproductivo. C. elegans es conocido por sus feromonas solubles en agua bien caracterizadas, los ascarósidos, que desempeñan diversas funciones en el desarrollo, el comportamiento y las interacciones sociales. Descubrimientos recientes han revelado una clase distinta de feromonas sexuales volátiles empleadas por los nematodos. Estas feromonas son producidas específicamente por hembras vírgenes de C. elegans y C. remanei sexualmente maduras y hermafroditas sin esperma, sirviendo como atrayente para los machos adultos 29,34,35. Este atrayente exhibe un notable dimorfismo sexual en su producción y percepción. La gónada somática femenina gobierna la síntesis de esta feromona sexual volátil, y la producción refleja dinámicamente el estado reproductivo, cesando al aparearse y reanudándose varias horas después29,34.

La comprensión de la comunicación de las feromonas sexuales de los nematodos proporciona información sobre la evolución de los sistemas de comunicación química, la interacción entre el estado reproductivo y el comportamiento, y los mecanismos subyacentes al procesamiento neuronal sexualmente dimórfico 24,26,36,37,38,39 . Los estudios implican a la neurona anfiforme AWA en los hombres como crítica para la detección de feromonas, con el receptor SRD-1 acoplado a la proteína G desempeñando un papel clave en la detección de feromonas en los hombres24. C. elegans es muy adecuado para estudiar la comunicación química de los animales, especialmente la señalización de feromonas sexuales, debido a su dependencia del sistema olfativo para la búsqueda de pareja. Si bien se sabe mucho sobre la señalización de ascarósido, el sistema de feromonas sexuales volátiles ofrece oportunidades únicas para la comparación 25,26,36,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,
51,52,53,54,55,56,57. Además, C. elegans es un poderoso organismo modelo genético debido a su genoma completamente secuenciado, su linaje celular claramente definido y sus mutantes olfativos bien caracterizados.

Sin embargo, los circuitos neuronales completos involucrados en el procesamiento de esta feromona, los cálculos que traducen su percepción en comportamientos específicos de búsqueda de pareja y su regulación de biosíntesis aún no se han dilucidado por completo. Las investigaciones adicionales sobre estos procesos son cruciales para comprender los diversos mecanismos que gobiernan la comunicación y los comportamientos reproductivos de los animales. La identificación de genes clave implicados en la síntesis, secreción y percepción de feromonas promete desvelar nuevos actores moleculares en la comunicación animal. Los ensayos descritos aquí proporcionan una base para abordar estas preguntas.

Protocol

1. Extracción cruda de feromonas sexuales de hembras y hermafroditas Protocolo para la sincronización de C. elegans Preparación de hembras adultas o hermafroditasMonitoree las placas de cultivo diariamente hasta que exista una gran población de hembras adultas/hermafroditas y la fuente de alimento OP50 se agote. Usando hembras de C. elegans y C . remanei de fog-2 para la extracción de feromonas sexuales crudas, pr…

Representative Results

Análisis de trayectoria de la percepción de feromonas sexuales volátiles en el ensayo de quimioatracciónEste ensayo de quimioatracción diferencia de forma fiable entre cepas de C . elegans de tipo salvaje y mutantes en su respuesta a las feromonas sexuales volátiles. Los experimentos exitosos con machos him-5 demuestran consistentemente una quimiotaxis robusta hacia la fuente de feromonas. Esto se refleja en un alto índice de quimiotaxis (C.I…

Discussion

Este protocolo proporciona una metodología robusta para la extracción de feromonas sexuales volátiles de C. elegans, junto con el establecimiento de un ensayo de quimioatracción robusto para medir las respuestas de quimioatracción masculina. Se puede encontrar información adicional en la guía del usuario de WormLab (consulte la Tabla de materiales); Para obtener un código básico para visualizar la trayectoria del movimiento del gusano, consulte la secci…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al Dr. Tingtao Zhou por diseñar y escribir el código para las visualizaciones de trayectorias utilizadas en nuestro análisis. Este trabajo contó con el apoyo financiero de R01 NS113119 (PWS), la beca postdoctoral senior Chen y el Instituto de Neurociencia de Tianqiao y Chrissy Chen.

Materials

10 cm Petri dishes Falcon 25373-100 Falcon bacteriological Petri dish 100 x 15 mm
6 cm Petri dishes Falcon 25373-085 Falcon bacteriological Petri dish 60 x 15 mm
C. remanei (EM464) CGC
Centrifuge Eppendorf centrifuge 5418  Any brand should work.
Chemoattraction assay plates Homemade solution N/A 1.5% agar, 25 mM NaCl, 1.5 mM Tris-base, and 3.5 mM Tris-Cl
Cholesterol Alfa Aesar 57-88-5
Dissecting Microscope Leica LeicaMZ75  Any brand should work.
E. Coli OP50 CGC
Ethanol Koptec 64-17-5
fog-2(q71) (JK574) CGC
him-5(e1490)(CB4088) CGC
Household bleach Clorox Germicidal bleach concentrated  Bleach
M9 buffer Homemade solution N/A 3 g KH2PO4, 11.3 g Na2HPO4.7H2O, 5 g NaCl, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Add 1 mL 1 M MgSO4 after cool down to room temperature.
Magnesium Sulfate, Anhydrous, Powder Macron M1063-500GM-EA
Microwave TOSHIBA N/A  Any brand should work.
N2 CGC
NaOH Sigma-aldrich S318-3 1 M
NGM plates solution Homemade solution N/A 2.5 g Peptone, 18 g agar, 3 g NaCl, H2O to 1 L.Sterilize by autoclaving. Once the autoclave is done (2 h), wait until the temperature of the medium drops to 65 °C. Put on a hotplate at 65 °C and stir. Then add the following, waiting 5 min between each to avoid crystallization: 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL K3PO4 (1 M, pH=6), 1 mL Cholesterol ( 5 mg/mL in ethanol).
Parafilm Bemis 13-374-10 Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film
Peptone VWR 97063-324
Pipet- aid Drummond Scientific  4-000-100  Any brand should work.
Plastic paper  Octago Waterproof Screen Printing Inkjet Transparency Film https://www.amazon.com/Octago-Waterproof-Transparency-Printing-Printers/dp/B08HJQWFGD
Potassium chloride Sigma-aldrich SLBP2366V
Potassium phosphate Spectrum 7778-77-0
Pipette Eppendorf SKU: EPPR4331; MFG#: 2231300006 20 – 200 µL, 100 – 1000 µL, any brand should work.
Rotator Labnet SKU: LI-H5500  Labnet H5500 Mini LabRoller with Dual Direction Rotator. Any brand should work.
Sodium chloride VWR 7647-14-5
sodium phosphate dibasic Sigma-aldrich SLCG3888
Tris-base Sigma-aldrich 77-86-1
Tris-Cl  Roche 1185-53-1
Tryptone VWR 97063-390
Vortex Scientific industries Vortex-Genie 2  Any brand should work.
WormLab system  MBF Bioscience N/A https://www.mbfbioscience.com/help/WormLab/Content/home.htm; https://www.mbfbioscience.com/products/wormlab/
Wormpicker Homemade  N/A made with platinum and glass pipet tips

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Wan, X., Sternberg, P. W. Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (210), e67115, doi:10.3791/67115 (2024).

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