Dieses Protokoll etabliert Methoden zur Extraktion und Quantifizierung von Reaktionen auf das flüchtige Sexualpheromon in C. elegans und stellt Werkzeuge zur Untersuchung der chemischen Kommunikation und Navigationsbahn zur Verfügung.
Chemische Kommunikation ist für die Gesundheit, die Fortpflanzung und das allgemeine Wohlbefinden des Organismus von entscheidender Bedeutung. Das Verständnis der molekularen Signalwege, neuronalen Prozesse und Berechnungen, die diese Signale steuern, ist nach wie vor ein aktives Forschungsgebiet. Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans bietet ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung dieser Prozesse, da er ein flüchtiges Sexualpheromon produziert. Dieses Pheromon wird von jungfräulichen Weibchen oder spermienarmen Hermaphroditen synthetisiert und dient als Lockstoff für Männchen.
Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Isolierung des flüchtigen Sexualpheromons aus mehreren C. elegans-Stämmen (WT-Stamm N2, daf-22 und fog-2) und C. remanei. Wir stellen auch ein Protokoll zur Quantifizierung der männlichen Chemotaxis-Reaktion auf das flüchtige Sexualpheromon zur Verfügung. Unsere Analyse verwendet Messungen wie den Chemotaxis-Index (C.I.), die Ankunftszeit (A.T.) und ein Trajektoriendiagramm, um die Reaktionen der Männchen unter verschiedenen Bedingungen genau zu vergleichen. Diese Methode ermöglicht robuste Vergleiche zwischen Männchen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund oder Entwicklungsstadien. Darüber hinaus ist der hier skizzierte Versuchsaufbau anpassbar, um andere Chemikalien der Chemoattraktion zu untersuchen.
Das Zusammenspiel zwischen chemischer Kommunikation und Fortpflanzungserfolg ist ein grundlegendes Prinzip im gesamten Tierreich 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Sexualpheromone lösen eine Vielzahl von sexuell dimorphen Verhaltensweisen aus, die für die Suche nach Partnern, die Koordination der Schritte bei der Suche und Anziehung eines Partners und letztendlich die Förderung der Fortpflanzung einer Spezies unerlässlichsind 11,12,13,14,15,16,17 . Beim Verständnis der Pheromonsignalisierung wurden erhebliche Fortschritte erzielt, aber die molekularen Mechanismen, neuronalen Schaltkreise und Rechenprozesse, die diese Wechselwirkungen steuern, sind oft unvollständig definiert 18,19,20,21,22,23,24,25,26.
Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans bietet ein leistungsfähiges Modell, um diese Fragen zu untersuchen. Bemerkenswert ist, dass C. elegans eine ungewöhnliche Fortpflanzungsstrategie aufweist – Hermaphroditen können sich selbst befruchten, aber auch mit Männchen auskreuzen 27,28,29,30,31,32,33. Diese Flexibilität erfordert ein robustes Kommunikationssystem, um den Fortpflanzungsstatus zu signalisieren. C. elegans ist bekannt für seine gut charakterisierten wasserlöslichen Pheromone, die Ascaroside, die eine vielfältige Rolle bei der Entwicklung, dem Verhalten und den sozialen Interaktionen spielen. Jüngste Entdeckungen haben eine eigene Klasse von flüchtigen Sexualpheromonen enthüllt, die von Nematoden verwendet werden. Diese Pheromone werden spezifisch von geschlechtsreifen C. elegans und C. remanei jungfräulichen Weibchen und spermienarmen Hermaphroditen produziert und dienen als Lockstoff für erwachsene Männchen 29,34,35. Dieser Lockstoff weist einen bemerkenswerten Sexualdimorphismus in seiner Herstellung und Wahrnehmung auf. Die weibliche somatische Gonade steuert die Synthese dieses flüchtigen Sexualpheromons, und die Produktion spiegelt dynamisch den Fortpflanzungsstatus wider, indem sie bei der Paarung aufhört und einige Stunden später wieder aufgenommen wird29,34.
Das Verständnis der Nematoden-Sexualpheromonkommunikation bietet Einblicke in die Evolution chemischer Kommunikationssysteme, das Zusammenspiel zwischen Fortpflanzungszustand und Verhalten sowie die Mechanismen, die der sexuell dimorphen neuronalen Verarbeitung zugrunde liegen 24,26,36,37,38,39. Studien deuten darauf hin, dass das amphidische Neuron AWA bei Männern entscheidend für die Pheromonerkennung ist, wobei der G-Protein-gekoppelte Rezeptor SRD-1 eine Schlüsselrolle bei der Pheromonerkennung bei Männern spielt24. C. elegans eignet sich gut für die Untersuchung der chemischen Kommunikation von Tieren, insbesondere der Sexualpheromonsignalisierung, da es bei der Partnersuche auf das olfaktorische System angewiesen ist. Während viel über die Ascarosid-Signalgebung bekannt ist, bietet das flüchtige Sexualpheromonsystem einzigartige Vergleichsmöglichkeiten 25,26,36,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,
51,52,53,54,55,56,57. Darüber hinaus ist C. elegans aufgrund seines vollständig sequenzierten Genoms, seiner klar definierten zellulären Abstammung und seiner gut charakterisierten Geruchsmutanten ein leistungsfähiger genetischer Modellorganismus.
Die vollständigen neuronalen Schaltkreise, die an der Verarbeitung dieses Pheromons beteiligt sind, die Berechnungen, die seine Wahrnehmung in gezieltes Partnersuchverhalten umsetzen, und seine Biosyntheseregulation müssen jedoch noch vollständig geklärt werden. Weitere Untersuchungen dieser Prozesse sind entscheidend für das Verständnis der vielfältigen Mechanismen, die die Kommunikation und das Fortpflanzungsverhalten von Tieren steuern. Die Identifizierung von Schlüsselgenen, die an der Synthese, Sekretion und Wahrnehmung von Pheromonen beteiligt sind, verspricht die Enthüllung neuer molekularer Akteure in der Tierkommunikation. Die hier beschriebenen Untersuchungsergebnisse bieten eine Grundlage, um diese Fragen zu beantworten.
Dieses Protokoll bietet eine robuste Methodik für die Extraktion flüchtiger Sexualpheromone aus C. elegans sowie die Etablierung eines robusten Chemoattraktionsassays zur Messung männlicher Chemoattraktionsreaktionen. Weitere Informationen finden Sie im WormLab-Benutzerhandbuch (siehe Materialtabelle); Einen grundlegenden Code zur Visualisierung der Bewegungsbahn der Schnecke finden Sie in Protokollabschnitt 7.3.8.5. Mehrere entscheidende Schritte im Protokol…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Dr. Tingtao Zhou für das Entwerfen und Schreiben des Codes für die Trajektorienvisualisierungen, die in unserer Analyse verwendet werden. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Finanzierung: R01 NS113119 (PWS), Chen Senior Postdoc Fellowship und das Tianqiao and Chrissy Chen Institute for Neuroscience.
10 cm Petri dishes | Falcon | 25373-100 | Falcon bacteriological Petri dish 100 x 15 mm |
6 cm Petri dishes | Falcon | 25373-085 | Falcon bacteriological Petri dish 60 x 15 mm |
C. remanei (EM464) | CGC | ||
Centrifuge | Eppendorf | centrifuge 5418 | Any brand should work. |
Chemoattraction assay plates | Homemade solution | N/A | 1.5% agar, 25 mM NaCl, 1.5 mM Tris-base, and 3.5 mM Tris-Cl |
Cholesterol | Alfa Aesar | 57-88-5 | |
Dissecting Microscope | Leica | LeicaMZ75 | Any brand should work. |
E. Coli OP50 | CGC | ||
Ethanol | Koptec | 64-17-5 | |
fog-2(q71) (JK574) | CGC | ||
him-5(e1490)(CB4088) | CGC | ||
Household bleach | Clorox Germicidal bleach concentrated | Bleach | |
M9 buffer | Homemade solution | N/A | 3 g KH2PO4, 11.3 g Na2HPO4.7H2O, 5 g NaCl, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Add 1 mL 1 M MgSO4 after cool down to room temperature. |
Magnesium Sulfate, Anhydrous, Powder | Macron | M1063-500GM-EA | |
Microwave | TOSHIBA | N/A | Any brand should work. |
N2 | CGC | ||
NaOH | Sigma-aldrich | S318-3 | 1 M |
NGM plates solution | Homemade solution | N/A | 2.5 g Peptone, 18 g agar, 3 g NaCl, H2O to 1 L.Sterilize by autoclaving. Once the autoclave is done (2 h), wait until the temperature of the medium drops to 65 °C. Put on a hotplate at 65 °C and stir. Then add the following, waiting 5 min between each to avoid crystallization: 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL K3PO4 (1 M, pH=6), 1 mL Cholesterol ( 5 mg/mL in ethanol). |
Parafilm | Bemis | 13-374-10 | Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film |
Peptone | VWR | 97063-324 | |
Pipet- aid | Drummond Scientific | 4-000-100 | Any brand should work. |
Plastic paper | Octago | Waterproof Screen Printing Inkjet Transparency Film | https://www.amazon.com/Octago-Waterproof-Transparency-Printing-Printers/dp/B08HJQWFGD |
Potassium chloride | Sigma-aldrich | SLBP2366V | |
Potassium phosphate | Spectrum | 7778-77-0 | |
Pipette | Eppendorf | SKU: EPPR4331; MFG#: 2231300006 | 20 – 200 µL, 100 – 1000 µL, any brand should work. |
Rotator | Labnet | SKU: LI-H5500 | Labnet H5500 Mini LabRoller with Dual Direction Rotator. Any brand should work. |
Sodium chloride | VWR | 7647-14-5 | |
sodium phosphate dibasic | Sigma-aldrich | SLCG3888 | |
Tris-base | Sigma-aldrich | 77-86-1 | |
Tris-Cl | Roche | 1185-53-1 | |
Tryptone | VWR | 97063-390 | |
Vortex | Scientific industries | Vortex-Genie 2 | Any brand should work. |
WormLab system | MBF Bioscience | N/A | https://www.mbfbioscience.com/help/WormLab/Content/home.htm; https://www.mbfbioscience.com/products/wormlab/ |
Wormpicker | Homemade | N/A | made with platinum and glass pipet tips |