Summary

Extraktion von flüchtigen Sexualpheromonen und Chemoattraction-Assay bei Caenorhabditis elegans

Published: August 09, 2024
doi:

Summary

Dieses Protokoll etabliert Methoden zur Extraktion und Quantifizierung von Reaktionen auf das flüchtige Sexualpheromon in C. elegans und stellt Werkzeuge zur Untersuchung der chemischen Kommunikation und Navigationsbahn zur Verfügung.

Abstract

Chemische Kommunikation ist für die Gesundheit, die Fortpflanzung und das allgemeine Wohlbefinden des Organismus von entscheidender Bedeutung. Das Verständnis der molekularen Signalwege, neuronalen Prozesse und Berechnungen, die diese Signale steuern, ist nach wie vor ein aktives Forschungsgebiet. Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans bietet ein leistungsfähiges Modell für die Untersuchung dieser Prozesse, da er ein flüchtiges Sexualpheromon produziert. Dieses Pheromon wird von jungfräulichen Weibchen oder spermienarmen Hermaphroditen synthetisiert und dient als Lockstoff für Männchen.

Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Isolierung des flüchtigen Sexualpheromons aus mehreren C. elegans-Stämmen (WT-Stamm N2, daf-22 und fog-2) und C. remanei. Wir stellen auch ein Protokoll zur Quantifizierung der männlichen Chemotaxis-Reaktion auf das flüchtige Sexualpheromon zur Verfügung. Unsere Analyse verwendet Messungen wie den Chemotaxis-Index (C.I.), die Ankunftszeit (A.T.) und ein Trajektoriendiagramm, um die Reaktionen der Männchen unter verschiedenen Bedingungen genau zu vergleichen. Diese Methode ermöglicht robuste Vergleiche zwischen Männchen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund oder Entwicklungsstadien. Darüber hinaus ist der hier skizzierte Versuchsaufbau anpassbar, um andere Chemikalien der Chemoattraktion zu untersuchen.

Introduction

Das Zusammenspiel zwischen chemischer Kommunikation und Fortpflanzungserfolg ist ein grundlegendes Prinzip im gesamten Tierreich 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Sexualpheromone lösen eine Vielzahl von sexuell dimorphen Verhaltensweisen aus, die für die Suche nach Partnern, die Koordination der Schritte bei der Suche und Anziehung eines Partners und letztendlich die Förderung der Fortpflanzung einer Spezies unerlässlichsind 11,12,13,14,15,16,17 . Beim Verständnis der Pheromonsignalisierung wurden erhebliche Fortschritte erzielt, aber die molekularen Mechanismen, neuronalen Schaltkreise und Rechenprozesse, die diese Wechselwirkungen steuern, sind oft unvollständig definiert 18,19,20,21,22,23,24,25,26.

Der Fadenwurm Caenorhabditis elegans bietet ein leistungsfähiges Modell, um diese Fragen zu untersuchen. Bemerkenswert ist, dass C. elegans eine ungewöhnliche Fortpflanzungsstrategie aufweist – Hermaphroditen können sich selbst befruchten, aber auch mit Männchen auskreuzen 27,28,29,30,31,32,33. Diese Flexibilität erfordert ein robustes Kommunikationssystem, um den Fortpflanzungsstatus zu signalisieren. C. elegans ist bekannt für seine gut charakterisierten wasserlöslichen Pheromone, die Ascaroside, die eine vielfältige Rolle bei der Entwicklung, dem Verhalten und den sozialen Interaktionen spielen. Jüngste Entdeckungen haben eine eigene Klasse von flüchtigen Sexualpheromonen enthüllt, die von Nematoden verwendet werden. Diese Pheromone werden spezifisch von geschlechtsreifen C. elegans und C. remanei jungfräulichen Weibchen und spermienarmen Hermaphroditen produziert und dienen als Lockstoff für erwachsene Männchen 29,34,35. Dieser Lockstoff weist einen bemerkenswerten Sexualdimorphismus in seiner Herstellung und Wahrnehmung auf. Die weibliche somatische Gonade steuert die Synthese dieses flüchtigen Sexualpheromons, und die Produktion spiegelt dynamisch den Fortpflanzungsstatus wider, indem sie bei der Paarung aufhört und einige Stunden später wieder aufgenommen wird29,34.

Das Verständnis der Nematoden-Sexualpheromonkommunikation bietet Einblicke in die Evolution chemischer Kommunikationssysteme, das Zusammenspiel zwischen Fortpflanzungszustand und Verhalten sowie die Mechanismen, die der sexuell dimorphen neuronalen Verarbeitung zugrunde liegen 24,26,36,37,38,39. Studien deuten darauf hin, dass das amphidische Neuron AWA bei Männern entscheidend für die Pheromonerkennung ist, wobei der G-Protein-gekoppelte Rezeptor SRD-1 eine Schlüsselrolle bei der Pheromonerkennung bei Männern spielt24. C. elegans eignet sich gut für die Untersuchung der chemischen Kommunikation von Tieren, insbesondere der Sexualpheromonsignalisierung, da es bei der Partnersuche auf das olfaktorische System angewiesen ist. Während viel über die Ascarosid-Signalgebung bekannt ist, bietet das flüchtige Sexualpheromonsystem einzigartige Vergleichsmöglichkeiten 25,26,36,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49,50,
51,52,53,54,55,56,57. Darüber hinaus ist C. elegans aufgrund seines vollständig sequenzierten Genoms, seiner klar definierten zellulären Abstammung und seiner gut charakterisierten Geruchsmutanten ein leistungsfähiger genetischer Modellorganismus.

Die vollständigen neuronalen Schaltkreise, die an der Verarbeitung dieses Pheromons beteiligt sind, die Berechnungen, die seine Wahrnehmung in gezieltes Partnersuchverhalten umsetzen, und seine Biosyntheseregulation müssen jedoch noch vollständig geklärt werden. Weitere Untersuchungen dieser Prozesse sind entscheidend für das Verständnis der vielfältigen Mechanismen, die die Kommunikation und das Fortpflanzungsverhalten von Tieren steuern. Die Identifizierung von Schlüsselgenen, die an der Synthese, Sekretion und Wahrnehmung von Pheromonen beteiligt sind, verspricht die Enthüllung neuer molekularer Akteure in der Tierkommunikation. Die hier beschriebenen Untersuchungsergebnisse bieten eine Grundlage, um diese Fragen zu beantworten.

Protocol

1. Rohe Extraktion von Sexualpheromonen aus Weibchen und Hermaphroditen Protokoll für die Synchronisation von C. elegans Vorbereitung von adulten Weibchen oder HermaphroditenÜberwachen Sie die Kulturplatten täglich, bis eine große Population adulter Weibchen/Hermaphroditen vorhanden ist und die OP50-Nahrungsquelle erschöpft ist. Unter Verwendung von fog-2 C. elegans und WT C. remanei Weibchen für die Extraktion v…

Representative Results

Trajektorienanalyse der flüchtigen Sexualpheromonwahrnehmung defekter Stamm im ChemoattraktionsassayDieser Chemoattraction-Assay unterscheidet zuverlässig zwischen Wildtyp- und mutierten Stämmen von C. elegans in ihrer Reaktion auf flüchtige Sexualpheromone. Erfolgreiche Experimente mit him-5-Männchen zeigen durchweg eine robuste Chemotaxis gegenüber der Pheromonquelle. Dies spiegelt sich in einem hohen Chemotaxis-Index (C.I.) (<strong class="…

Discussion

Dieses Protokoll bietet eine robuste Methodik für die Extraktion flüchtiger Sexualpheromone aus C. elegans sowie die Etablierung eines robusten Chemoattraktionsassays zur Messung männlicher Chemoattraktionsreaktionen. Weitere Informationen finden Sie im WormLab-Benutzerhandbuch (siehe Materialtabelle); Einen grundlegenden Code zur Visualisierung der Bewegungsbahn der Schnecke finden Sie in Protokollabschnitt 7.3.8.5. Mehrere entscheidende Schritte im Protokol…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Dr. Tingtao Zhou für das Entwerfen und Schreiben des Codes für die Trajektorienvisualisierungen, die in unserer Analyse verwendet werden. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Finanzierung: R01 NS113119 (PWS), Chen Senior Postdoc Fellowship und das Tianqiao and Chrissy Chen Institute for Neuroscience.

Materials

10 cm Petri dishes Falcon 25373-100 Falcon bacteriological Petri dish 100 x 15 mm
6 cm Petri dishes Falcon 25373-085 Falcon bacteriological Petri dish 60 x 15 mm
C. remanei (EM464) CGC
Centrifuge Eppendorf centrifuge 5418  Any brand should work.
Chemoattraction assay plates Homemade solution N/A 1.5% agar, 25 mM NaCl, 1.5 mM Tris-base, and 3.5 mM Tris-Cl
Cholesterol Alfa Aesar 57-88-5
Dissecting Microscope Leica LeicaMZ75  Any brand should work.
E. Coli OP50 CGC
Ethanol Koptec 64-17-5
fog-2(q71) (JK574) CGC
him-5(e1490)(CB4088) CGC
Household bleach Clorox Germicidal bleach concentrated  Bleach
M9 buffer Homemade solution N/A 3 g KH2PO4, 11.3 g Na2HPO4.7H2O, 5 g NaCl, H2O to 1 L. Sterilize by autoclaving. Add 1 mL 1 M MgSO4 after cool down to room temperature.
Magnesium Sulfate, Anhydrous, Powder Macron M1063-500GM-EA
Microwave TOSHIBA N/A  Any brand should work.
N2 CGC
NaOH Sigma-aldrich S318-3 1 M
NGM plates solution Homemade solution N/A 2.5 g Peptone, 18 g agar, 3 g NaCl, H2O to 1 L.Sterilize by autoclaving. Once the autoclave is done (2 h), wait until the temperature of the medium drops to 65 °C. Put on a hotplate at 65 °C and stir. Then add the following, waiting 5 min between each to avoid crystallization: 1 mL CaCl2 (1 M), 1 mL MgSO4 (1 M), 25 mL K3PO4 (1 M, pH=6), 1 mL Cholesterol ( 5 mg/mL in ethanol).
Parafilm Bemis 13-374-10 Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film
Peptone VWR 97063-324
Pipet- aid Drummond Scientific  4-000-100  Any brand should work.
Plastic paper  Octago Waterproof Screen Printing Inkjet Transparency Film https://www.amazon.com/Octago-Waterproof-Transparency-Printing-Printers/dp/B08HJQWFGD
Potassium chloride Sigma-aldrich SLBP2366V
Potassium phosphate Spectrum 7778-77-0
Pipette Eppendorf SKU: EPPR4331; MFG#: 2231300006 20 – 200 µL, 100 – 1000 µL, any brand should work.
Rotator Labnet SKU: LI-H5500  Labnet H5500 Mini LabRoller with Dual Direction Rotator. Any brand should work.
Sodium chloride VWR 7647-14-5
sodium phosphate dibasic Sigma-aldrich SLCG3888
Tris-base Sigma-aldrich 77-86-1
Tris-Cl  Roche 1185-53-1
Tryptone VWR 97063-390
Vortex Scientific industries Vortex-Genie 2  Any brand should work.
WormLab system  MBF Bioscience N/A https://www.mbfbioscience.com/help/WormLab/Content/home.htm; https://www.mbfbioscience.com/products/wormlab/
Wormpicker Homemade  N/A made with platinum and glass pipet tips

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Wan, X., Sternberg, P. W. Volatile Sex Pheromone Extraction and Chemoattraction Assay in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (210), e67115, doi:10.3791/67115 (2024).

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