Визуализация кальция in vivo гранулярных клеток зубчатой извилины гиппокампа у мышей

Предыдущие исследования показали, что гиппокамп является структурой мозга, необходимой для обработки и извлечения воспоминаний ^1,2. С 1950-х годов нейронные цепи гиппокампа у грызунов были в центре внимания при изучении формирования, хранения и^{извлечения памяти}. Анатомические структуры в пределах гиппокампа включают субрегионы зубчатой извилины (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 и субикулума⁴. Между этими субобластями существуют сложные двунаправленные связи, из которых DG, CA1 и CA3 образуют заметную трисинаптическую цепь, состоящую из гранулярных клеток и пирамидальных клеток⁵. Эта схема получает первичный вход от энторинальной коры (ЭК) и является классической моделью для изучения синаптической пластичности. Предыдущие исследования функции гиппокампа in vivo в основном были сосредоточены на CA1 ^6,7 из-за его более легкого доступа. В то время как нейроны CA1 играют важную роль в формировании, консолидации и извлечении памяти, особенно в клетках пространственной памяти, другие субрегионы гиппокампа^{также жизненно важны.} В частности, последние исследования выявили функции ДГ в формировании памяти. Сообщалось, что клетки места в DG более стабильны, чем в CA1¹⁰, и их активность отражает контекстно-зависимую информацию¹¹. Кроме того, активно-зависимая маркировка гранулярных клеток DG может быть реактивирована для индуцирования поведения, связанного с^{памятью 12}. Таким образом, чтобы получить более глубокое понимание кодирования информации в DG, крайне важно исследовать деятельность субрегиона DG в то время, когда животное выполняет задачи, зависящие от памяти.

В предыдущих исследованиях активности ДГ в основном использовалась электрофизиология in vivo ¹³. Однако у этого метода есть некоторые недостатки: во-первых, при электрических записях может быть трудно напрямую идентифицировать различные типы клеток, которые генерируют сигнал. Регистрируемые сигналы поступают как от тормозных, так и от возбуждающих клеток. Таким образом, для разделения этих двух типов ячеек требуются дополнительные методы обработки данных. Кроме того, трудно объединить информацию о других типах клеток, такую как подгруппы, специфичные для проекции, или маркировка, зависящая от активности, с электрическими записями. Кроме того, из-за анатомической морфологии ДГ записывающие электроды часто имплантируются в ортогональном направлении, что сильно ограничивает количество нейронов, которые могут быть зарегистрированы. Таким образом, с помощью электрических записей трудно обеспечить мониторинг сотен отдельных нейронов из структуры ДГ у одного и того же животного¹⁴.

Дополнительным методом регистрации активности нейронов при ДГ является использование визуализации кальция in vivo ¹⁵. Ионы кальция имеют основополагающее значение для клеточных сигнальных процессов в организмах, играя решающую роль во многих физиологических функциях, особенно в нервной системе млекопитающих. Когда нейроны активны, внутриклеточная концентрация кальция быстро увеличивается, отражая динамический характер активности нейронов и передачи сигналов. Таким образом, запись изменений внутриклеточного уровня кальция в нейронах в режиме реального времени дает важную информацию о механизмах нейронного кодирования.

Технология визуализации кальция использует специализированные флуоресцентные красители или генетически модифицированные индикаторы кальция (GECI) для мониторинга концентраций ионов кальция в нейронах путем обнаружения изменений в интенсивности флуоресценции, которые затем могут быть зафиксированы с помощью микроскопической^{визуализации}. Как правило, используется семейство генов-индикаторов кальция GCaMP, включающее зеленый флуоресцентный белок (GFP), кальмодулин и полипептидные последовательности M13. GCaMP может излучать зеленую флуоресценцию при связывании с ионами кальция¹⁷, что позволяет регистрировать колебания зеленой флуоресценции с помощью визуализации¹⁸. Кроме того, для получения четких изображений целевой области мозга обычно имплантируется линзы с градиентным индексом (линза GRIN) над исследуемой областью. Линза GRIN позволяет визуализировать глубокую область мозга, к которой невозможно получить доступ непосредственно с поверхности.

Этот метод относительно легко комбинировать с другими генетическими инструментами для маркировки различных типов клеток. Более того, поскольку плоскость визуализации параллельна ориентации клеток в DG, сотни нейронов доступны для визуализации при каждой успешной операции. В этой работе мы представляем полный и подробный протокол хирургического вмешательства для визуализации кальция in vivo в зубчатой извилине у мышей (Рисунок 1). Процедура включает в себя две основные операции. Первый из них заключается в введении вируса AAV-CaMKIIα-GCaMP6f в DG. Вторая операция заключается в имплантации линзы GRIN над местом инъекции вируса. Эти две процедуры проводятся за один и тот же сеанс. После восстановления после этих операций следующим шагом является проверка качества изображения с помощью миниатюрных микроскопов (минископов). Если поле визуализации содержит сотни активных клеток, последующая процедура заключается в прикреплении опорной пластины минископа к черепу мыши с помощью стоматологического цемента; Затем мышь можно использовать для экспериментов по визуализации. Мы также представляем конвейер предварительной обработки на основе MATLAB для оптимизации анализа собранных данных о кальции.