フローサイトメトリーによるピロトーシスの検討
Summary
この記事では、ニワトリGSDMEのN末端フラグメント(chGSDME-NT)およびヨウ化プロピジウム(PI)に対する抗体による二重染色後のフローサイトメトリーを使用したピロトーシス細胞の同定について説明します。
Abstract
ピロトーシスは、主に切断されたガスデルミン(GSDM)ファミリータンパク質から生成されるN末端による原形質膜細孔の形成によって引き起こされる炎症性のプログラム細胞死です。ウェスタンブロットによるメンブレン付着GSDM-NTの検査は、ピロトーシスの評価に最も一般的に使用される方法です。しかし、この方法を用いてピロトーシスを有する細胞を他の形態の細胞死と鑑別することは困難です。本研究では、Infectious Bursal Disease Virus(IBDV)に感染したDF-1細胞をモデルとして、ニワトリGSDMEのN末端フラグメントに対する特異的抗体(chGSDME-NT)およびヨウ化プロピジウム(PI)染色を用いて、フローサイトメトリーによるピロトーシスを受ける細胞の割合を定量化しました。chGSDME-NT陽性細胞は、Alexa Fluor 647標識抗chGSDME-NT抗体を用いたフローサイトメトリーで容易に検出できました。さらに、IBDV感染細胞におけるchGSDME-NT/PI二重陽性細胞の割合(約33%)は、模擬感染対照群よりも有意に高かった(P < 0.001)。これらの知見は、フローサイトメトリーによる膜結合chGSDME-NTの検討が、細胞死を経験した細胞のうちピロトーシス細胞を決定するための有効なアプローチであることを示しています。
Introduction
ピロトーシスは、主に哺乳類のガスダーミン(GSDM)Dによる原形質膜細孔の形成に依存する炎症性のプログラム細胞死です1,2,3。ニワトリのGSDMDの遺伝的欠損4,5のために、ニワトリのピロトーシスのメカニズムはとらえどころのないままです。ガスデルミンファミリーは、GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME、およびDFNB59 3,6などの保存されたタンパク質で構成されています。研究によると、魚類やアヒル由来のGSDMEは、カスパーゼ-1/3/7またはカスパーゼ-3/7によって切断され、ピロトーシス細胞死を誘導することが報告されています7,8。しかし、ニワトリの病原性感染症に対する宿主応答におけるGSDME媒介性ピロトーシスの役割は、まだ解明されていません。
感染性滑液包疾患(IBD)は、IBDV9によって引き起こされる急性で感染力が強く、免疫抑制性の家禽疾患です。IBDVは、非エンベロープ二分節二本鎖(ds)RNAウイルスで、ビルナウイルス科のアビビルナウイルス属に属します10。他の研究者や当研究室によるこれまでの研究では、IBDV感染は異なる経路11,12,13,14を介して宿主細胞の細胞死を誘導することが分かっています。これまでの知見では、IBDV感染が溶解性細胞死の指標である乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)の放出を引き起こすことが実証されており6,15、IBDV感染が宿主細胞の溶解性細胞死を誘導することが示唆されています。さらに、IBDVに感染した細胞は、原形質膜から大きな気泡が吹き出される細胞腫脹やヨウ化プロピジウム(PI)染色陽性など、ピロトーシス細胞死の形態学的特徴を示すことが示されており、IBDV感染が細胞内のピロトーシスを誘導することを示唆しています。
切断されたGSDMのN末端フラグメント(GSDM-NT)によるピロトーシス細胞の膜孔の形成がピロトーシスの特徴であることを考えると、理論的には、特異的抗体を用いて細胞膜上のGSDM-NTを調べることにより、ピロトーシス細胞をフローサイトメトリーで検出できると考えられます。鳥類のピロトーシス細胞では、ニワトリガスデルミンE(chGSDME-NT)のN末端断片が膜孔を形成し、ヨウ化プロピジウム(PI)がDNAを通過して結合することを可能にします。したがって、ピロトーシス細胞の割合はフローサイトメトリーを用いて検出することができ、それによりピロトーシスを他の形態の細胞死、例えばアポトーシスおよび壊死と区別することができる。しかし、フローサイトメトリーによるピロトーシス細胞の検査法は報告されていません。本研究では、DF-1細胞にIBDVを感染させ、chGSDME-NTフラグメント(膜結合)に対するモノクローナル抗体(MCAB)を用いたピロトーシス細胞の検討とPI染色を行った。驚くべきことに、ピロトーシス細胞はフローサイトメトリーによって効果的に検出されました。さらに、ピロトーシス細胞の割合を定量化することができました。これらの知見は、発熱症を判定するための強力で効果的な手段を提供します。
本稿では、IBDV感染細胞のピロトーシスをフローサイトメトリーにより、抗chGSDME-NT McAbおよびPI染色を用いて検討する方法について述べます。この方法は、他の病原体感染細胞にも拡張でき、ピロトーシスを呈するさまざまな細胞タイプを調べるために適用でき、他の形態の細胞死と区別できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
この記事では、Alexa Fluor 647 標識抗 chGSDME-NT MCAB と PI による感染細胞の二重染色により、フローサイトメトリーを使用してピロトーシスを調べる効果的な方法について説明します。このアプローチは、ピロトーシスをアポトーシスや壊死などの他のタイプの細胞死と区別するために、さまざまな細胞タイプにも適用できます。
ピロトーシスは、哺乳類<sup class="xref"…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ジュエ・リュウ博士のご協力に感謝いたします。本研究は、中国国家重点研究開発プログラム(No.2022YFD1800300)、中国国家自然科学基金会(No.32130105)、現代農工業技術研究システム予算基金(No.CARS-40)、中国。
Materials
| 5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 antibody labeling kits | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0227 | |
| CellQuest software | BD Biosciences | ||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Cryogenic Freezing Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Hemocytometer | Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx strain | IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China | ||
| Inverted Microscope | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
| Normal Mouse IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | M&C Gene Technology | CC017 | |
| Propidium Iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | M&C Gene Technology | CC008 | |
| Vortex Oscillator | MIULAB | MIX-28+ |
Referencias
- He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Angosto-Bazarra, D., et al. Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality. BMC Biol. 20 (1), 9 (2022).
- De Schutter, E., et al. Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins. Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).
- Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
- Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis. J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).
- Li, H., et al. Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis. Front Immunol. 13, 1078526 (2022).
- Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future. Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).
- Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA. J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).
- Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha. J Virol. 92 (11), (2018).
- Duan, X., et al. Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication. J Virol. 94 (2), e01724-e01819 (2020).
- Li, Z., et al. Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5. J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).
- Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).
- Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. Methods for monitoring cancer cell pyroptosis. Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis. Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).
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