Onderzoek van pyroptose door middel van flowcytometrie
Summary
Dit artikel beschrijft de identificatie van pyroptotische cellen met behulp van flowcytometrie na dubbele kleuring met antilichamen tegen het N-terminale fragment van kip GSDME (chGSDME-NT) en propidiumjodide (PI).
Abstract
Pyroptose is een inflammatoir type geprogrammeerde celdood dat voornamelijk wordt aangedreven door de vorming van plasmamembraanporiën door de N-terminus die wordt gegenereerd uit de eiwitten van de familie Cleaved Gasdermin (GSDM). Onderzoek van membraan-gehechte GSDM-NT door Western Blot is de meest gebruikte methode voor het evalueren van pyroptose. Het is echter moeilijk om met deze methode cellen met pyroptose te onderscheiden van andere vormen van celdood. In deze studie werden met Infectious Bursal Disease Virus (IBDV) geïnfecteerde DF-1-cellen gebruikt als model om het aandeel cellen dat pyroptose onderging te kwantificeren door middel van flowcytometrie, met behulp van specifieke antilichamen tegen het N-terminale fragment van kip GSDME (chGSDME-NT) en propidiumjodide (PI) kleuring. De chGSDME-NT-positieve cellen waren gemakkelijk detecteerbaar door flowcytometrie met behulp van Alexa Fluor 647-gelabelde antilichamen tegen chGSDME-NT. Bovendien was het aandeel chGSDME-NT/PI dubbelpositieve cellen in IBDV-geïnfecteerde cellen (ongeveer 33%) significant groter dan in nep-geïnfecteerde controles (P < 0,001). Deze bevindingen geven aan dat onderzoek van membraangebonden chGSDME-NT door middel van flowcytometrie een effectieve benadering is voor het bepalen van pyroptotische cellen onder cellen die celdood ondergaan.
Introduction
Pyroptose is een inflammatoir type geprogrammeerde celdood dat voornamelijk afhangt van de vorming van plasmamembraanporiën door Gasdermin (GSDM) D bij zoogdieren 1,2,3. Vanwege de genetische deficiëntie van GSDMD bij kippen 4,5, blijft het mechanisme van pyroptose bij kippen ongrijpbaar. De Gasdermin-familie omvat geconserveerde eiwitten, waaronder GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME en DFNB59 3,6. Studies hebben gemeld dat GSDME van teleostvissen en eenden wordt gesplitst door caspase-1/3/7 of caspase-3/7 om pyroptotische celdood te induceren 7,8. De rol van GSDME-gemedieerde pyroptose in de gastheerrespons op pathogene infecties bij kippen moet echter nog worden opgehelderd.
Infectieuze bursale ziekte (IBD) is een acute, zeer besmettelijke en immunosuppressieve pluimveeziekte die wordt veroorzaakt door IBDV9. IBDV, een niet-omhuld dubbelsegmentig dubbelstrengs (ds) RNA-virus, behoort tot het geslacht Avibirnavirus in de familie Birnaviridae10. Eerdere studies door anderen en ons laboratorium hebben aangetoond dat IBDV-infectie celdood induceert in gastheercellen via verschillende routes 11,12,13,14. Eerdere bevindingen hebben aangetoond dat IBDV-infectie de afgifte van lactaatdehydrogenase (LDH) veroorzaakt, een indicator van lytische celdood 6,15, wat suggereert dat IBDV-infectie lytische celdood in gastheercellen induceert. Bovendien tonen de gegevens aan dat IBDV-geïnfecteerde cellen morfologische kenmerken van pyroptotische celdood vertonen, waaronder celzwelling met grote bellen die uit het plasmamembraan blazen en propidiumjodide (PI)-kleuring positief, wat suggereert dat IBDV-infectie pyroptose in cellen induceert.
Aangezien de vorming van membraanporiën in pyroptotische cellen door het N-terminale fragment van gespleten GSDM (GSDM-NT) een kenmerk is van pyroptose, zouden pyroptotische cellen theoretisch kunnen worden gedetecteerd door flowcytometrie door GSDM-NT op het celmembraan te onderzoeken met behulp van specifieke antilichamen. In pyroptotische cellen van vogels vormt het N-terminale fragment van kippengasdermin E (chGSDME-NT) membraanporiën, waardoor propidiumjodide (PI) erdoorheen kan gaan en DNA kan binden. Het aandeel pyroptotische cellen kan dus worden gedetecteerd met behulp van flowcytometrie, waardoor pyroptose wordt onderscheiden van andere vormen van celdood, zoals apoptose en necrose. De methode voor het onderzoeken van pyroptotische cellen door middel van flowcytometrie is echter niet gerapporteerd. In deze studie werden DF-1-cellen geïnfecteerd met IBDV en werd flowcytometrie uitgevoerd om pyroptotische cellen te onderzoeken met behulp van monoklonale antilichamen (McAb) tegen het chGSDME-NT-fragment (membraangebonden) en PI-kleuring. Verrassend genoeg werden pyroptotische cellen effectief gedetecteerd door flowcytometrie. Bovendien kon het aandeel pyroptotische cellen worden gekwantificeerd. Deze bevindingen bieden een krachtig en effectief middel om pyroptose te bepalen.
Dit artikel beschrijft een methode voor het onderzoeken van pyroptose in IBDV-geïnfecteerde cellen door middel van flowcytometrie met behulp van anti-chGSDME-NT, McAb en PI-kleuring. Deze methode kan ook worden uitgebreid naar andere met ziekteverwekkers geïnfecteerde cellen en worden toegepast om verschillende celtypen met pyroptose te onderzoeken, waarbij ze worden onderscheiden van andere vormen van celdood.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft een effectieve methode voor het onderzoeken van pyroptose met behulp van flowcytometrie, bereikt door dubbele kleuring van geïnfecteerde cellen met Alexa Fluor 647-gelabelde anti-chGSDME-NT McAb en PI. Deze benadering kan ook worden toegepast op verschillende celtypen om pyroptose te onderscheiden van andere soorten celdood, zoals apoptose en necrose.
Pyroptose, een inflammatoir type geprogrammeerde celdood dat voornamelijk afhankelijk is van Gasdermin (GSDM)…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen Dr. Jue Liu bedanken voor zijn vriendelijke hulp. Deze studie werd ondersteund door subsidies van het National Key Research and Development Program of China (nr. 2022YFD1800300), de National Natural Science Foundation of China (nr. 32130105) en het Earmarked Fund for Modern Agro-Industry Technology Research System (nr. AUTO’S-40), China.
Materials
| 5 mL round-bottom polystyrene tube (12 × 75 mm) | Corning Falcon | 352052 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Alexa Fluor 647 antibody labeling kits | Thermo Fisher Scientific | A20186 | |
| Anti-chGSDME-CT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0228 | |
| Anti-chGSDME-NT McAb | SAE Biomedical Tech Company (Zhongshan, China) | EU0227 | |
| CellQuest software | BD Biosciences | ||
| CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 3100 | |
| Cryogenic Freezing Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by Life Technologies | C11995500BT | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F0193-500ML | |
| Flow Cytometer | BD Biosciences | FACSCalibur | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | Thermo Fisher Scientific | 00-4222-26 | |
| Hemocytometer | Qiu-jing Biochemical Reagent & Instrument Company (Shanghai, China) | YX-JSB52 | |
| IBDV Lx strain | IBDV Lx strain was kindly provided by Dr. Jue Liu, Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing, China | ||
| Inverted Microscope | Chongqing Photoelectric Instrument Company | XDS-1B | |
| Normal Mouse IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | M&C Gene Technology | CC017 | |
| Propidium Iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | M&C Gene Technology | CC008 | |
| Vortex Oscillator | MIULAB | MIX-28+ |
Referencias
- He, W. T., et al. Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion. Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).
- Kayagaki, N., et al. Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling. Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).
- Shi, J., et al. Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death. Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).
- Angosto-Bazarra, D., et al. Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality. BMC Biol. 20 (1), 9 (2022).
- De Schutter, E., et al. Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins. Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).
- Kovacs, S. B., Miao, E. A. Gasdermins: Effectors of pyroptosis. Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).
- Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis. J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).
- Li, H., et al. Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis. Front Immunol. 13, 1078526 (2022).
- Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future. Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).
- Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA. J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).
- Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha. J Virol. 92 (11), (2018).
- Duan, X., et al. Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication. J Virol. 94 (2), e01724-e01819 (2020).
- Li, Z., et al. Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5. J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).
- Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).
- Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. Methods for monitoring cancer cell pyroptosis. Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).
- Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
- Chen, X., et al. Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis. Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).
.