Quantification de l’engloutissement microglial du matériel synaptique à l’aide de la cytométrie en flux

Une vue générale de la procédure expérimentale est illustrée graphiquement à la figure 1A. Toutes les expériences impliquant la manipulation d’animaux vivants ont été effectuées dans le strict respect de la loi allemande sur la protection des animaux et ont été approuvées par le Bureau régional de la santé et des services sociaux de Berlin (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlin, Allemagne). Les souris ont été hébergées en groupe dans des cages ventilées dans des conditions de laboratoire standard avec un cycle lumière/obscurité de 12:12 h dans l’installation centrale pour animaux du Centre Max Delbrück de médecine moléculaire (MDC). De la nourriture et de l’eau ont été fournies à volonté. Voir le tableau 1 pour la composition des tampons et des réactifs et le tableau des matériaux pour les détails relatifs à tous les réactifs, instruments et matériaux utilisés dans ce protocole. Pour le test spécifique de vGLUT1, nous avons utilisé le terme in vivo* tout au long du manuscrit pour reconnaître que la cytométrie en flux nécessite une homogénéisation des tissus et un isolement cellulaire, et que les microglies présentent une viabilité d’environ 95 % après la procédure d’isolement (Figure 1B et Figure supplémentaire S1). Par conséquent, ils conservent leur capacité à engloutir le matériel synaptique ex vivo, pendant une courte période, jusqu’à la fixation. Ainsi, la quantification de la microglie vGLUT1+ comprend à la fois l’engloutissement in vivo et ex vivo à court terme jusqu’à l’étape de fixation. 1. Coloration intracellulaire vGLUT1 pour la détection de l’engloutissement in vivo* des synapses glutamatergiques par la microglie REMARQUE : La procédure d’isolement cellulaire suivante est adaptée dela 16. Toutes les étapes de l’isolement cellulaire doivent être effectuées sur de la glace. Anesthésier les souris à l’aide d’une injection intrapéritonéale de pentobarbital. Perfuser les souris par voie intracardique avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) glacée pendant ~2 min.REMARQUE : Une souris est utilisée par échantillon (n). Retirer le cerveau du crâne et le conserver dans 1 mL de milieu cellulaire neural.REMARQUE : Le milieu cellulaire neural, tel que le milieu Hibernate-A, est utilisé pour assurer une viabilité élevée des cellules après le processus de dissociation tissulaire. Transférez le cerveau dans une boîte de Pétri remplie de 1 ml de milieu cellulaire neural glacé et disséquez l’hippocampe comme décrit précédemment17. Transférez l’hippocampe dans un homogénéisateur Dounce rempli de 1 ml de milieu cellulaire neural et dissociez le tissu à l’aide du pilon lâche avec environ ~25 coups doux. Placez une passoire de 70 μm sur un tube de polypropylène de 5 ml et ajoutez 500 μL de milieu cellulaire neural. Transférez l’homogénat de tissu dans le tube de polypropylène de 5 mL à travers la passoire. Rincer l’homogénéisateur Dounce 2 fois avec 1 mL de milieu cellulaire neural froid et centrifuger les échantillons à 400 × g pendant 8 min. Aspirez le surnageant et remettez le granulé en suspension dans 500 μL de DPBS glacé par pipetage doux. Assurer une suspension homogène et compléter le volume final à 1,5 mL à l’aide de DPBS. Ajoutez 500 μL de solution isotonique de Percoll à l’échantillon, remettez-le doucement en suspension et recouvrez-le de 2 ml supplémentaires de DPBS froid. Centrifuger les échantillons à 3 000 × g pendant 10 min avec une accélération maximale et sans frein. Aspirez la couche supérieure ainsi que le disque de myéline dans la phase intermédiaire.REMARQUE : Toutes les étapes de centrifugation suivantes sont effectuées à 4 oC sauf indication contraire. Ajouter 4 mL de DPBS froid et centrifuger les échantillons à 400 × g pendant 10 min. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 100 μL de solution de coloration de viabilité fixable et incuber les échantillons pendant 30 min à 4 °C. Ajouter 1 mL de DPBS froid à l’échantillon et centrifuger les échantillons à 300 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant et ajouter 100 μL de solution de coloration CD16/CD32 (1/200 dans un tampon FACS). Vortex pendant ~5 s et incubation pendant 10 min à 4 °C.REMARQUE : La coloration CD16/CD32 est un prétraitement visant à minimiser la liaison non spécifique des anticorps aux cellules porteuses de FcR, telles que la microglie, avant des applications telles que la cytométrie en flux. Ajouter 1 mL de tampon FACS à l’échantillon et centrifuger à 300 × g pendant 5 min. Aspirez le surnageant et ajoutez 100 μL de colorant master mix-I (1/100 anti-CD11b/ anti-CD45 + 1/200 anti-Ly6C/ anti-Ly6G dans 1x tampon FACS). Incuber les échantillons pendant 20 min à 4°C dans l’obscurité. Ajouter 1 mL de tampon FACS à l’échantillon et centrifuger à 300 × g pendant 5 min. Remettre le granulé en suspension dans 250 μL de tampon de fixation. Incuber à 4 °C pendant 25 min. Ajouter 2 mL de tampon de perméabilisation (PERM) et centrifuger 300 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant et ajouter 100 μL de vGLUT1 ou de solution de coloration de contrôle des isotypes. Agiter pendant ~5 s et incuber les échantillons à 4 °C pendant 50 min. Ajouter 2 ml de 1 tampon PERM et centrifuger 300 × g pendant 5 min. Jeter le surnageant et ajouter 2 mL de tampon FACS aux échantillons. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min et jeter le surnageant. Remettez les cellules en suspension dans 250 μL de tampon FACS et faites passer les échantillons à travers un filtre à crépine de 40 μm. Analysez l’intensité de fluorescence de vGLUT1 à partir d’une microglie simple/viable/CD11b++/CD45+ à l’aide de la cytométrie en flux. Utilisez les macrophages de la rate comme contrôle négatif pour chaque expérience.Isolez les splénocytes en comprimant doucement le tissu de la rate haché à travers un filtre à crépine de 70 μm à deux reprises. Rincez les filtres avec 40 mL de DPBS et récupérez la suspension dans un tube conique de 50 mL. Centrifugez 350 × g pendant 10 min et remettez en suspension la pastille obtenue dans une solution de 1 mL de tampon de lyse des globules rouges. Incuber 10 min sur glace. Ajouter 10 mL de DPBS à l’échantillon après l’incubation et centrifuger à 350 × g pendant 10 min. Procédez aux étapes de coloration expliquées entre les étapes 1.11 et 1.17.REMARQUE : La stratégie de contrôle est fournie dans la figure supplémentaire S2 pour définir les macrophages de la rate comme CD11b ++/ CD45 ++/ Population cellulaire viable. Stratégie de contrôle (Figure 1)Porte primaire : ajustez la zone de diffusion vers l’avant (FSC-A) [axe x] et la zone de diffusion latérale (SSC-A) [axe y] pour inclure la population de microglie dans la zone fermée et exclure les débris cellulaires. Ajustez la zone de diffusion vers l’avant (FSC-A) [axe x] et la hauteur de diffusion vers l’avant (FSC-H) [axe y] pour exclure les doublets. Les maillots apparaissent en diagonale sur ce graphique à points. Ajustez CD11b-PECy7 [axe y] et CD45-APC [axe x] et fixez la population avec un niveau de surface élevé de CD11b et un niveau moyen de CD45 sous forme de microglie. Excluez les cellules mortes dans la porte négative FITC[axe y]. FACULTATIF : Excluez également les cellules qui sont positives pour Ly6C- et Ly6G-FITC dans la porte FITC-négative pour exclure les macrophages associés au SNC de l’analyse.REMARQUE : Contrairement aux cellules vivantes, les cellules mortes dont les membranes sont compromises permettent au colorant de viabilité fixable de pénétrer dans le cytoplasme, ce qui augmente la quantité de marquage protéique18. Ainsi, les cellules mortes seront plus brillantes que les cellules vivantes, qui sont incluses dans la porte définie. Ajustez CD45-APC [axe x] et vGLUT1-PE [axe y] ; la population qui se trouve au-dessus du seuil de contrôle, où aucun événement positif n’a été détecté dans l’échantillon de rate (contrôle biologique négatif interne, figure 1E) est considérée comme la fraction vGLUT1-positive dans l’échantillon. 2. Détection de l’engloutissement in vitro de synaptosomes bruts par la microglie Préparation brute de synaptosomes et étiquetage rouge pHrodoREMARQUE : Toutes les étapes suivantes doivent se dérouler sur de la glace.Suivez les étapes 1.1 à 1.2. Transférez le cerveau dans une boîte de Pétri remplie de 1 ml de milieu cellulaire neural glacé et disséquez soigneusement l’hippocampe. Gardez toujours la boîte de Pétri sur de la glace. Utilisez l’hippocampe pour l’isolement de la microglie à l’étape suivante. Transférez le reste du cerveau (à l’exception du cervelet et du bulbe olfactif) dans un homogénéisateur Dounce rempli de 1 mL de réactif d’extraction de protéines synaptiques et dissociez doucement le tissu à l’aide du pilon lâche avec environ ~30 frappes. Compléter le comprimé d’inhibiteur de protéase par 10 mL de réactif d’extraction et isoler les synaptosomes selon les instructions du fabricant.REMARQUE : Les réactifs d’extraction de protéines synaptiques, tels que SynPER19, sont utilisés pour préparer des synaptosomes contenant des protéines pré- et postsynaptiques biologiquement actives. Dissoudre la pastille de synaptosome brute dans 500 μL d’une solution de CO3 0,1 M Na,2. Colorer l’échantillon de synaptosome avec 10 μL de 0,2 mM de pHrodo Red. Incuber les échantillons de synaptosomes bruts à température ambiante (24-25 °C) pendant 1,5 h en agitant doucement. Ajouter 1 mL de DPBS froid sur l’échantillon, centrifuger pendant 1 min à pleine vitesse (20 815 × g) et aspirer le surnageant. Répétez l’étape 2.1.5 pour 7 fois au total afin d’éliminer l’excès de pHrodo Red non lié des échantillons. Après la dernière centrifugeuse, effectuez un test BCA standard pour quantifier les concentrations en protéines de l’échantillon. Facultatif : congélation instantanée d’échantillons de synaptosomes dans du DPBS avec 5 % de DMSO à l’aide d’azote liquide et conservation pendant 3 semaines à -80 °C. Couvrez les tubes avec du papier d’aluminium pour maintenir l’exposition à la lumière minimale. In vitro Essai d’engloutissement des synaptosomes bruts à l’aide d’une microglie adulte fraîchement isoléePréparez un LCR et équilibrez-le avec 95 % d’O2:5 % de CO2 pendant 30 min.REMARQUE : Pour les étapes 2.2.2 à 2.2.4, suivez les instructions du fabricant pour la préparation de la solution de digestion à base de papaïne. Ajouter 4 mL de LCRa dans le flacon 2 du kit de papaïne. Placez le flacon dans un bain-marie à 37 °C pendant ~10 min jusqu’à ce que la solution de papaïne apparaisse claire. Ajouter 400 μL d’aCSF dans le flacon 3 du kit de papaïne. Mélanger doucement pendant ~10 fois par pipetage lent. Ajouter 200 μL du flacon 3 au flacon 2 (reconstitué à l’étape 2.2.3). Conservez le reste de la fiole 3. Prenez l’hippocampe disséqué à l’étape 2.1.2 et émincez l’hippocampe disséqué à l’aide d’un scalpel. Transférez l’hippocampe haché dans un tube de dissociation tissulaire rempli de 2 ml de solution enzymatique préparée à l’étape 2.2.5. Placez le tube dans le dissociateur tissulaire et exécutez le programme : 37C_ABDK_01 (prend ~30 min). Placez les échantillons dans un bain-marie à 37 °C pendant ~20 min et triturez le mélange toutes les 5 min à l’aide d’une pipette de 1 mL sans faire de bulles.REMARQUE : Ce processus doit être poursuivi jusqu’à ce que le tissu soit complètement dissocié et apparaisse complètement homogène pour assurer une dissociation efficace. Toutes les étapes de centrifugation suivantes sont effectuées à 4 °C, sauf indication contraire. Retirer délicatement la suspension à cellules troubles dans un nouveau tube de 15 mL et centrifuger à 300 × g pendant 5 min. Pendant cette période de 5 minutes, préparer le mélange de lavage suivant (5 ml) par échantillon ; ajouter 500 μL de solution d’inhibiteur de l’albumine-ovomucoïde reconstituée fournie dans la trousse de papaïne à 4,5 mL de LCRa. Ajouter le reste de la solution dans le flacon 3 de l’étape 2.2.5 au mélange de lavage. Jeter le surnageant de l’étape 2.2.8 et remettre immédiatement en suspension la pastille de cellule dans la solution de mélange de lavage. Passez l’échantillon à travers un filtre de 70 μm dans un nouveau tube de microcentrifugation de 5 mL. Centrifuger les échantillons à 300 × g pendant 5 min. Procédez à l’étape de centrifugation à gradient Percoll expliquée précédemment aux étapes 1.7-1.9. Remettez soigneusement les cellules en suspension dans le tampon de coloration MACS en pipetant lentement de haut en bas. Incuber les échantillons pendant 15 min à 4 °C. Ajouter 1 mL de tampon MACS à chaque échantillon et centrifuger à 300 × g pendant 8 min. Remettez les cellules en suspension dans 500 μL de tampon MACS. Placez les colonnes de sélection positive dans le séparateur magnétique. Équilibrez les colonnes en les rinçant avec 3 mL de MACS Buffer. Mélangez délicatement et appliquez 500 μL de suspension cellulaire sur la colonne. Lavez les colonnes 3 fois avec 3 mL de tampon MACS. Retirez les colonnes du séparateur magnétique et placez-les sur des tubes coniques de 15 ml. Ajoutez 5 ml de tampon MACS sur la colonne et rincez immédiatement les cellules à l’aide d’un repulpeur. Centrifuger les échantillons à 300 × g pendant 10 min. Pendant cette période, préparer 20 mL de FBS à 40 % dans du DPBS. Préchauffer 1 mL de DMEM par échantillon jusqu’à 37 °C dans un bain-marie. Dissoudre la pastille de cellule finale dans 1 mL de DMEM préchauffé. Ensemencez environ ~150 000 à 200 000 cellules dans 500 μL de DMEM préchauffé par puits dans une plaque à 24 puits. Comme témoin, ensemencez un nombre similaire de cellules dans 1 à 2 puits supplémentaires. Vérifiez la confluence des cellules dans tous les puits à l’aide d’un microscope optique.REMARQUE : Si la région cérébrale cible est l’hippocampe ou des régions cérébrales de taille comparable, 5 souris peuvent être regroupées par échantillon (n) pour isoler ~150 000 microglies. Pour l’ensemble du cerveau, 1 souris par n suffira pour obtenir un nombre similaire de cellules en utilisant les deux protocoles d’isolement. Alternativement, ~40 000 cellules peuvent être plaquées dans des plaques de 96 puits dans un volume final de 100 μL pour commencer l’essai d’engloutissage. Cela réduit le nombre de cellules analysées mais réduit également le nombre de souris utilisées par n. La privation de protéines due à l’absence de FCS dans le DMEM déclenchera la phagocytose. Incuber la plaque pendant 1 à 2 h dans l’incubateur (37 °C et 5% CO2).REMARQUE : Cette étape vise à ce que les cellules se remettent des effets sujets au stress de la procédure d’isolement avant le début de l’essai d’engloutissement fonctionnel. Prélevez très lentement 250 μL de milieu dans chaque puits, ajoutez 250 μL de DMEM frais préchauffé dans chaque puits et ajoutez 3 μg de synaptosomes marqués en rouge pHRodo sur le dessus. Vérifiez la confluence cellulaire dans tous les puits à l’aide d’un microscope optique.Pour les puits de contrôle négatifs, ajoutez la même quantité de synaptosomes non marqués au puits supplémentaire ensemencé de cellules. Pour les puits d’essai, assurez-vous que le puits 1 ne contient que des cellules ; puits 2 contient des cellules + synaptosomes non marqués ; well-3 contient des cellules + 3 μg de pHrodo Red ; bien 4 contient du DMEM + 3 μg de pHrodo Red. Incuber les cellules avec des synaptosomes pendant 2 h dans l’incubateur (37 °C et 5% CO2). Sortez le milieu et lavez les puits avec du DPBS froid. Ajouter 200 μL de solution de trypsine/EDTA par puits pour détacher les cellules pendant 35 s. Ajouter 1 mL de FBS à 40 % de DPBS par puits et transférer les cellules dans un tube de polypropylène de 5 mL à travers la passoire. Gardez la plaque et le tube sur de la glace pendant ce processus pour faciliter le détachement des cellules. Lavez chaque puits 2 fois avec 500 μL de DPBS glacé. Centrifuger les échantillons prélevés à 500 × g pendant 5 min. Remettre les cellules en suspension dans la solution de coloration contenant 1/200 CD16/CD32 dans 100 μL de tampon FACS et incuber pendant 10 min sur de la glace. Après l’incubation, ajouter CD11b et CD45 à la solution de coloration avec une concentration finale de 1/100 de chacun. Incuber les échantillons pendant 20 min à 4 °C dans l’obscurité. Lavez les échantillons avec 1 mL de tampon FACS et centrifugez-les à 300 × g pendant 10 min. Remettre la pastille en suspension dans 250 μL de tampon FACS et enregistrer au moins 100 000 événements au total à l’aide de la cytométrie en flux. Analysez l’intensité de fluorescence du rouge pHrodo à partir de la microglie CD11b++/CD45+ . Stratégie de contrôle (figure 2C)Ajustez la porte principale : zone de diffusion vers l’avant (FSC-A) [axe x] et zone de diffusion latérale (SSC-A) [axe x] pour inclure la population de microglie dans la zone fermée et exclure les débris cellulaires. Ajustez la zone de diffusion vers l’avant (FSC-A) [axe x] et la hauteur de diffusion vers l’avant (FSC-H) [axe y] pour exclure les doublets. Les maillots apparaissent en diagonale sur ce graphique à points. Ajustez CD11b-PECy7 [axe y] et CD45-APC [axe x] et limitez la population avec un niveau de surface élevé CD11b et un niveau moyen de CD45 sous forme de microglie. Calculez l’intensité médiane de fluorescence de pHrodo-PE à partir de cette population. Utilisez les mêmes cellules incubées avec des synaptosomes non marqués comme contrôle négatif.