原代小鼠 CD8+ T 细胞的实时体外迁移测定
Summary
该协议提供了一种在特定环境条件下进行原代小鼠T细胞分离的方法和T细胞迁移的延时显微镜检查，并进行了定量分析。
Abstract
适应性免疫反应依赖于 T 细胞在血液、淋巴和组织中迁移以响应病原体和异物的能力。T细胞迁移是一个复杂的过程，需要协调来自环境和局部免疫细胞的许多信号输入，包括趋化因子、趋化因子受体和粘附分子。此外，T 细胞运动受周围动态环境线索的影响，这些线索可以改变激活状态、转录景观、粘附分子表达等。 在体内，这些看似交织在一起的因素的复杂性使得很难区分有助于T细胞迁移的单个信号。该协议提供了从T细胞分离到计算机辅助分析的一系列方法，以在高度特定的环境条件下实时评估T细胞迁移。这些条件可能有助于阐明调节迁移的机制，提高我们对T细胞动力学的理解，并提供通过动物实验难以获得的强有力的机制证据。更深入地了解影响细胞迁移的分子相互作用对于开发改进的治疗方法非常重要。
Introduction
T细胞是适应性抗原特异性免疫反应的主要效应因子。在群体水平上，T细胞是异质的，由具有不同特化功能的细胞亚群组成。重要的是，CD8+ T 细胞是免疫系统的主要细胞溶解效应因子，可直接消除感染或功能失调的细胞1。
成熟的CD8+ T细胞存在于组织中，并通过血液和淋巴管循环以寻找抗原。在感染过程中，T 细胞在血液或组织中呈递抗原，并迅速流向脾脏或最近的引流淋巴结，开始产生有效的免疫反应。在任何一种情况下，T细胞都会被激活，进行克隆扩增，并离开淋巴系统进入血液，如果还没有的话。在此过程中，细胞内信号传导导致淋巴归巢受体下调，并上调许多对组织特异性迁移至关重要的整合素和趋化因子受体2。最终，T 细胞向感染部位的定向迁移是由包括整合素和趋化因子信号传导在内的收敛环境信号驱动的。
趋化因子大致可分为两大类：（1） 稳态信号，对分化、存活和基础功能至关重要，以及 （2） 炎症信号，如 CXCL9、CXCL10 和 CCL3，是趋化性所必需的。通常，趋化因子除了激活整合素表达外，还会产生驱动定向迁移的信号梯度，称为趋化性1。趋化性受到精细调节且高度敏感，T细胞能够对梯度的微小变化做出反应，这些变化可以引导它们朝向特定方向或位置。
除了这些 T 细胞相关因素外，迁移还受到细胞外基质 （ECM） 组成和密度的影响。ECM 由密集的蛋白质网络组成，包括胶原蛋白和蛋白聚糖，它们为 T 细胞上的粘附整合素受体提供支架。整合素是一个多样化的跨膜蛋白家族，每个跨膜蛋白都具有高度特化的结合域和下游信号转导效应。整合素受体在 T 细胞表面的动态表达使其能够快速适应其不断变化的环境3.重要的是，整合素将 ECM 和细胞内细胞骨架肌动蛋白网络连接起来，它们共同产生 T 细胞运动所需的推进力。
总之，迁移模式根据免疫细胞表型或环境信号而变化。这些复杂的生物过程受到 T 细胞、周围细胞和局部感染组织表面细胞因子、趋化因子和整合素表达的严格调控。 在体内，这些迁移机制可能很复杂，并且可能由几个加性信号4 产生。由于这种复杂性，不可能在看似环环相扣的变量之间建立因果关系。为了克服这个问题，有几种 体外 方法来研究 T 细胞迁移的特定方面，例如对特定趋化因子信号的反应以及 T 细胞整合素与 ECM 结合蛋白之间的相互作用。该协议解决了分离和激活小鼠 CD8+ T 细胞的方法，包括二维空间中的 体外 迁移测定和用于分析指定 T 细胞迁移的计算分析工具。这些方法对用户是有利的，因为它们不需要复杂的材料或设备，就像文献中描述的其他一些细胞迁移测定一样。使用这些方法生成的细胞迁移数据可以以简单的方式提供免疫反应的证据，从而可以在 体内进行进一步的、明智的研究。
Protocol
动物协议得到了罗切斯特大学动物资源委员会的批准。本研究中的小鼠保持在罗切斯特大学动物设施的无病原体空间中。本研究使用雄性/雌性 C57BL/6 小鼠，年龄为 6-12 周 （15-30 g）。小鼠组织分离可以在工作台上进行，手套覆盖双手，面罩覆盖鼻子和嘴巴，或在生物安全柜内进行。所有细胞培养和板制备必须在生物安全柜中进行。本研究中使用的试剂和设备列在 材料表中。 <p class…
Representative Results
可以通过流式细胞术确认 T 细胞活化，寻找 CD69 和 CD44 的表达增加，它们是小鼠 T 细胞活化的典型标志物6。此外，可以通过流式细胞术测定 CD3+ CD8+ T 细胞的 T 细胞群的纯度。该方法产生 >90% CD8+ T 细胞群。 T细胞迁移可以通过软件辅助细胞追踪程序进行评估，这些程序既可重复又可调，以满足研究者的需求。用于确定实验效果的一些?…
Discussion
理解体内收敛信号的生物学影响具有挑战性，而且不容易解释。本文介绍的方案提供了一种合理的方法来理解在高度定义和生物学相关条件下的 T 细胞迁移。这些条件可以根据研究者的判断来指定，并且可以修改方案以适应各种 T 细胞群、激活状态和细胞表型的需求。此外，许多配体和受体可以通过这些定义的抗体阻断 7,8 和配体包被玻璃程序<su…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢Kim实验室的前任和现任成员，他们随着时间的推移为这些协议的开发做出了贡献。代表性数据由P01 AI102851/AI/NIAID NIH HHS/United States和P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/United States提供。该出版物的部分原因在于机构 Ruth L. Kirschstein 国家研究服务奖的资助编号 T32 GM135134。
Materials
| 10 cm dish | Corning | 353003 | or equivalent |
| 15 mL conical tube | ThermoFisher | 339650 | or equivalent |
| 1x DPBS | Gibco | 14190144 | without calcium and without magnesium |
| 6 well plate non-TC treated | Corning | 3736 | or equivalent |
| 70 µm cell strainer | FisherScientific | 352350 | or equivalent |
| ACK lysing buffer | ThermoFisher | A1049201 | or equivalent |
| Allegra 6KR centrifuge | ThermoScientific | sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket | or equivalent |
| Beta mercaptoethanol | Sigma | M3148 | or equivalent |
| CellTrace Violet | ThermoFisher | C34571 | Or equivalent |
| Centrifuge | ThermoScientific | Sorvall ST 16R | or equivalent |
| Collagen (IV) | Corning | 354233 | or equivalent |
| DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear | Bioptechs | 04200417C | |
| Dynabeads Sheep anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| DynaMag 15 Magnet | ThermoFisher Scientific | 12301D | or equivalent |
| Easy sep mouse T cell isolation kit | Stem Cell | 19851 | |
| FBS | SigmaAldrich | F2442-500ML | or equivalent |
| Fibronectin | SigmaAldrich | 10838039001 | or equivalent |
| Fiji | http://fiji.sc/ | weblink | |
| Filter cubes | Nikon or Olympus | ||
| GK1.5 | ATCC | TIB-207 | |
| HEPES | ThermoFisher | 15630080 | or equivalent |
| HQ CCD camera | CoolSNAP | or equivalent | |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/h | weblink | |
| ImageJ automatic tracking plug in | http://imagej.net/TrackMate | weblink | |
| ImageJ manual tracking plug in | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | weblink | |
| L-15 | Various | See Materials | Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose |
| Liebovitz's L-15 medium, no phenol red | ThermoFisher | 21083027 | |
| Luer Lok disposable syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | or equivalent |
| Lymphocyte separation medium | Corning | 25-072-CI | or equivalent |
| M5/114 | ATCC | TIB-120 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140050 | or equivalent |
| Microscope heating system | Okolab | okolab.com | Custom designs available |
| Millicell EZ slide | Millipore | C86024 | |
| Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit | Biolegend | 480043 | |
| Mouse E-cadherin | R&D systems | 8875-EC-050 | or equivalent |
| Mouse surgical dissection kit | Fisher Scientific | 13-820-096 | or equivalent |
| NIS elements | Nikon | Software | |
| non-TC 24wp | Corning | 353047 | or equivalent |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | or equivalent |
| Protein A | ThermoFisher Scientific | or equivalent | |
| R9 | Various | See Materials | Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) |
| Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera | R&D systems | 796-IC-050 | or equivalent |
| Recombinant Mouse IL2 | Biolegend | 575410 | or equivalent |
| RPMI 1640x | ThermoFisher | 11875093 | or equivalent |
| T pins | Fisher Scientific | S99385 | or equivalent |
| TE2000-U microscope | Nikon | or equivalent | |
| Various recombinant mouse chemokine | R&D systems | or equivalent | |
| VCAM-1 Fc chimera | R&D systems | 643-VM-050 | or equivalent |
| Volocity | PerkinElmer | Software |
Referencias
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Citar este artículo
Ryan, A. T., Dahal, A., Mir, S., Kim, M., Lim, K. Real-Time In Vitro Migration Assay for Primary Murine CD8+ T Cells. J. Vis. Exp. (207), e66580, doi:10.3791/66580 (2024).