مقايسة الهجرة في الوقت الحقيقي في المختبر لخلايا الفئران الأولية CD8 + T
Summary
يوفر هذا البروتوكول طريقة لعزل الخلايا التائية الأولية للفأر والفحص المجهري بفاصل زمني لهجرة الخلايا التائية في ظل ظروف بيئية محددة مع التحليل الكمي.
Abstract
تعتمد الاستجابة المناعية التكيفية على قدرة الخلية التائية على الانتقال عبر الدم والليمفاوية والأنسجة استجابة لمسببات الأمراض والأجسام الغريبة. هجرة الخلايا التائية هي عملية معقدة تتطلب تنسيق العديد من مدخلات الإشارة من البيئة والخلايا المناعية المحلية ، بما في ذلك الكيموكينات ومستقبلات الكيموكين وجزيئات الالتصاق. علاوة على ذلك ، تتأثر حركة الخلايا التائية بالإشارات البيئية المحيطة الديناميكية ، والتي يمكن أن تغير حالة التنشيط ، والمناظر الطبيعية للنسخ ، وتعبير جزيء الالتصاق ، والمزيد. في الجسم الحي ، يجعل تعقيد هذه العوامل المتشابكة على ما يبدو من الصعب التمييز بين الإشارات الفردية التي تساهم في هجرة الخلايا التائية. يوفر هذا البروتوكول سلسلة من الطرق من عزل الخلايا التائية إلى التحليل بمساعدة الكمبيوتر لتقييم هجرة الخلايا التائية في الوقت الفعلي في ظل ظروف بيئية محددة للغاية. قد تساعد هذه الظروف في توضيح الآليات التي تنظم الهجرة ، وتحسين فهمنا لحركية الخلايا التائية وتوفير أدلة ميكانيكية قوية يصعب تحقيقها من خلال التجارب على. إن الفهم الأعمق للتفاعلات الجزيئية التي تؤثر على هجرة الخلايا أمر مهم لتطوير علاجات محسنة.
Introduction
الخلايا التائية هي المستجيبات الرئيسية للاستجابة المناعية التكيفية المتخصصة لمولد الضد. على مستوى المجتمع الإحصائي، الخلايا التائية غير متجانسة، وتتكون من مجموعات فرعية خلوية ذات وظائف متخصصة متميزة. الأهم من ذلك ، أن الخلايا التائية CD8 + هي المستجيبات الخلوية الرئيسية للجهاز المناعي ، والتي تقضي بشكل مباشر على الخلايا المصابة أو المختلةوظيفيا 1.
تتواجد الخلايا التائية CD8+ الناضجة في الأنسجة وتنتشر عبر الدم والليمفاوية بحثا عن المستضدات. أثناء العدوى، تقدم الخلايا التائية مولدات ضد في الدم أو الأنسجة، وتصرف بسرعة إلى الطحال أو أقرب عقدة ليمفاوية مصاصة لبدء استجابة مناعية مثمرة. في كلتا الحالتين، تنشط الخلايا التائية، وتخضع للتوسع النسيلي، وتترك الجهاز الليمفاوي ليدخل الدم، إن لم يكن موجودا بالفعل. خلال هذه العملية ، تمنح الإشارات داخل الخلايا خفض تنظيم مستقبلات التوجيه اللمفاوية وتنظيم العديد من مستقبلات الانتغرين والكيموكين الضرورية للهجرة الخاصةبالأنسجة 2. في نهاية المطاف ، فإن الهجرة الموجهة للخلايا التائية إلى مواقع العدوى مدفوعة بإشارات بيئية متقاربة تشمل إشارات الانتغرين والكيموكين.
يمكن تصنيف الكيموكينات على نطاق واسع إلى فئتين رئيسيتين: (1) إشارات الاستتباب ، والتي تعتبر ضرورية للتمايز والبقاء والوظيفة القاعدية ، و (2) الإشارات الالتهابية ، مثل CXCL9 و CXCL10 و CCL3 ، وهي مطلوبة للانجذاب الكيميائي. بشكل عام ، تخلق chemokines تدرج إشارة يدفع الهجرة الاتجاهية ، والمعروفة باسم الانجذاب الكيميائي ، بالإضافة إلى تنشيط تعبير integrin1. الانجذاب الكيميائي منظم بدقة وحساس للغاية ، مع الخلايا التائية القادرة على الاستجابة للتغيرات الصغيرة في التدرج التي يمكن أن تقودها نحو اتجاه أو موقع معين.
بالإضافة إلى هذه العوامل المرتبطة بالخلايا التائية ، تتأثر الهجرة أيضا بتكوين وكثافة المصفوفة خارج الخلية (ECM). يتكون ECM من شبكة كثيفة من البروتينات ، بما في ذلك الكولاجين والبروتيوغليكان ، والتي توفر سقالة لمستقبلات الأنتغرين اللاصقة على الخلايا التائية. Integrins هي عائلة متنوعة من البروتينات عبر الغشاء ، ولكل منها مجالات ربط عالية التخصص وتأثيرات إشارات المصب. يتيح التعبير الديناميكي لمستقبلات الأنتغرين على سطح الخلية التائية التكيف السريع مع بيئاتها المتغيرة3. الأهم من ذلك ، يربط الأنتغرين ECM وشبكات الأكتين الهيكلية الخلوية داخل الخلايا التي تعمل معا لتوليد القوة الدافعة المطلوبة لحركة الخلايا التائية.
باختصار ، تختلف أنماط الهجرة بناء على النمط الظاهري للخلايا المناعية أو الإشارات البيئية. يتم تنظيم هذه العمليات الحيوية المعقدة بإحكام عن طريق التعبير عن السيتوكينات والكيموكينات والأنتغرينات على سطح الخلية التائية والخلايا المحيطة والأنسجة المحلية المصابة. في الجسم الحي ، يمكن أن تكون آليات الهجرة هذه معقدة وقد تنتج عن عدة إشارات مضافة4. بسبب هذا التعقيد ، قد يكون من المستحيل إقامة علاقة سببية بين المتغيرات المتشابكة على ما يبدو. للتغلب على هذا ، هناك العديد من الأساليب في المختبر لدراسة جوانب محددة من هجرة الخلايا التائية مثل الاستجابة لإشارات كيموكين محددة والتفاعل بين إنتغرينات الخلايا التائية وبروتينات ربط ECM. يتناول هذا البروتوكول طرقا لعزل وتنشيط خلايا الفئران CD8 + T ، مع مقايسات الهجرة في المختبر في الفضاء ثنائي الأبعاد وأدوات التحليل الحسابي لتحليل هجرة الخلايا التائية المحددة. هذه الطرق مفيدة للمستخدم لأنها لا تتطلب مواد أو أجهزة متطورة ، كما هو الحال مع بعض فحوصات هجرة الخلايا الأخرى الموضحة في الأدبيات. يمكن أن توفر بيانات هجرة الخلايا التي تم إنشاؤها باستخدام هذه الطرق دليلا على الاستجابات المناعية بطريقة مبسطة تتيح مزيدا من التحقيق المستنير في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
إن فهم التأثير البيولوجي للإشارات المتقاربة في الجسم الحي أمر صعب وليس من السهل تفسيره. توفر البروتوكولات المقدمة هنا طريقة معقولة لفهم هجرة الخلايا التائية في ظروف محددة للغاية وذات صلة بيولوجية. يمكن تحديد هذه الشروط بناء على تقدير الباحث ، ويمكن تعديل البروتوكولات لتناسب احتياجا…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الأعضاء السابقين والحاليين في مختبر كيم الذين ساهموا في تطوير هذه البروتوكولات بمرور الوقت. تم توفير البيانات التمثيلية بواسطة P01 AI102851/الذكاء الاصطناعي/NIAID NIH HHS/الولايات المتحدة و P01 HL018208/HL/NHLBI NIH HHS/الولايات المتحدة. أصبح هذا المنشور ممكنا جزئيا بفضل المنحة رقم T32 GM135134 من جائزة روث إل كيرششتاين المؤسسية لخدمة البحوث الوطنية.
Materials
| 10 cm dish | Corning | 353003 | or equivalent |
| 15 mL conical tube | ThermoFisher | 339650 | or equivalent |
| 1x DPBS | Gibco | 14190144 | without calcium and without magnesium |
| 6 well plate non-TC treated | Corning | 3736 | or equivalent |
| 70 µm cell strainer | FisherScientific | 352350 | or equivalent |
| ACK lysing buffer | ThermoFisher | A1049201 | or equivalent |
| Allegra 6KR centrifuge | ThermoScientific | sorvall 16R with tx400 3655 rotor and bucket | or equivalent |
| Beta mercaptoethanol | Sigma | M3148 | or equivalent |
| CellTrace Violet | ThermoFisher | C34571 | Or equivalent |
| Centrifuge | ThermoScientific | Sorvall ST 16R | or equivalent |
| Collagen (IV) | Corning | 354233 | or equivalent |
| DeltaT culture dish .17 mm thick glass clear | Bioptechs | 04200417C | |
| Dynabeads Sheep anti-Rat IgG | Invitrogen | 11035 | |
| DynaMag 15 Magnet | ThermoFisher Scientific | 12301D | or equivalent |
| Easy sep mouse T cell isolation kit | Stem Cell | 19851 | |
| FBS | SigmaAldrich | F2442-500ML | or equivalent |
| Fibronectin | SigmaAldrich | 10838039001 | or equivalent |
| Fiji | http://fiji.sc/ | weblink | |
| Filter cubes | Nikon or Olympus | ||
| GK1.5 | ATCC | TIB-207 | |
| HEPES | ThermoFisher | 15630080 | or equivalent |
| HQ CCD camera | CoolSNAP | or equivalent | |
| ImageJ | http://imagej.nih.gov/ij/h | weblink | |
| ImageJ automatic tracking plug in | http://imagej.net/TrackMate | weblink | |
| ImageJ manual tracking plug in | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html | weblink | |
| L-15 | Various | See Materials | Medium Recipe: Leibovitz’s L-15 medium without phenol red (Gibco) supplemented with 1-5 g/L glucose |
| Liebovitz's L-15 medium, no phenol red | ThermoFisher | 21083027 | |
| Luer Lok disposable syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | or equivalent |
| Lymphocyte separation medium | Corning | 25-072-CI | or equivalent |
| M5/114 | ATCC | TIB-120 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | ThermoFisher | 11140050 | or equivalent |
| Microscope heating system | Okolab | okolab.com | Custom designs available |
| Millicell EZ slide | Millipore | C86024 | |
| Mojosort mouse CD8+ Naïve T cell isolation kit | Biolegend | 480043 | |
| Mouse E-cadherin | R&D systems | 8875-EC-050 | or equivalent |
| Mouse surgical dissection kit | Fisher Scientific | 13-820-096 | or equivalent |
| NIS elements | Nikon | Software | |
| non-TC 24wp | Corning | 353047 | or equivalent |
| Penicillin-streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | or equivalent |
| Protein A | ThermoFisher Scientific | or equivalent | |
| R9 | Various | See Materials | Medium Recipe: RPMI 1640x supplemented with 10 % FBS, 1 % antibiotic-antimycotic (Gibco), 20 mM HEPES buffer (Gibco), 1 % MEM Non-Essential Amino Acids (Gibco), 50 μM β-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich) |
| Recombinant mouse ICAM-1 Fc chimera | R&D systems | 796-IC-050 | or equivalent |
| Recombinant Mouse IL2 | Biolegend | 575410 | or equivalent |
| RPMI 1640x | ThermoFisher | 11875093 | or equivalent |
| T pins | Fisher Scientific | S99385 | or equivalent |
| TE2000-U microscope | Nikon | or equivalent | |
| Various recombinant mouse chemokine | R&D systems | or equivalent | |
| VCAM-1 Fc chimera | R&D systems | 643-VM-050 | or equivalent |
| Volocity | PerkinElmer | Software |
Referencias
- Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235 (2023).
- Fowell, D. J., Kim, M. The spatio-temporal control of effector T cell migration. Nat Rev Immunol. 21 (9), 582-596 (2021).
- Tabdanov, E. D., et al. Engineering t cells to enhance 3d migration through structurally and mechanically complex tumor microenvironments. Nat Commun. 12 (1), 2815 (2021).
- Kameritsch, P., Renkawitz, J. Principles of leukocyte migration strategies. Trends Cell Biol. 30 (10), 818-832 (2020).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse naive CD4+ T cell isolation and in vitro differentiation into t cell subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
- Sailer, C. J., et al. Pd-1(hi) CAR-T cells provide superior protection against solid tumors. Front Immunol. 14, 1187850 (2023).
- Lim, K., Hyun, Y. M., Lambert-Emo, K., Topham, D. J., Kim, M. Visualization of integrin mac-1 in vivo. J Immunol Methods. 426, 120-127 (2015).
- Lim, K., et al. Neutrophil trails guide influenza-specific CD8+ T cells in the airways. Science. 349, 4352 (2015).
- Lim, K., et al. In situ neutrophil efferocytosis shapes T cell immunity to influenza infection. Nat Immunol. 21 (9), 1046-1057 (2020).
- Reilly, E. C., et al. T(rm) integrins CD103 and CD49a differentially support adherence and motility after resolution of influenza virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (22), 12306-12314 (2020).
- Amitrano, A. M., et al. Optical control of CD8(+) T cell metabolism and effector functions. Front Immunol. 12, 666231 (2021).
- Xu, Y., et al. Optogenetic control of chemokine receptor signal and t-cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), 6371-6376 (2014).
- Capece, T., et al. A novel intracellular pool of IFA-1 is critical for asymmetric CD8(+) T cell activation and differentiation. J Cell Biol. 216 (11), 3817-3829 (2017).
- Hirai, T., Whitley, S. K., Kaplan, D. H. Migration and function of memory CD8(+) T cells in skin. J Invest Dermatol. 140 (4), 748-755 (2020).
- Mouchacca, P., Schmitt-Verhulst, A. M., Boyer, C. Visualization of cytolytic T cell differentiation and granule exocytosis with T cells from mice expressing active fluorescent granzyme B. PLoS One. 8 (6), e67239 (2013).
- Nuzzi, P. A., Lokuta, M. A., Huttenlocher, A. Analysis of neutrophil chemotaxis. Methods Mol Biol. 370, 23-36 (2007).
- Heit, B., Tavener, S., Raharjo, E., Kubes, P. An intracellular signaling hierarchy determines direction of migration in opposing chemotactic gradients. J Cell Biol. 159 (1), 91-102 (2002).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2), 606-616 (1977).
- Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis. Integr Biol (Camb). 2 (11-12), 648-658 (2010).
- Sai, J., Walker, G., Wikswo, J., Richmond, A. The IL sequence in the LLKIL motif in CXCR2 is required for full ligand-induced activation of Erk, Akt, and chemotaxis in HL60 cells. J Biol Chem. 281 (47), 35931-35941 (2006).
- Choi, Y., Sunkara, V., Lee, Y., Cho, Y. K. Exhausted mature dendritic cells exhibit a slower and less persistent random motility but retain chemotaxis against ccl19. Lab Chip. 22 (2), 377-386 (2022).
- Harding, M. G., Zhang, K., Conly, J., Kubes, P. Neutrophil crawling in capillaries: A novel immune response to staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 10 (10), e1004379 (2014).
- Rommerswinkel, N., Niggemann, B., Keil, S., Zanker, K. S., Dittmar, T. Analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix. J Vis Exp. (92), e51963 (2014).
- Wu, P. H., Giri, A., Sun, S. X., Wirtz, D. Three-dimensional cell migration does not follow a random walk. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (11), 3949-3954 (2014).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Overstreet, M. G., et al. Inflammation-induced interstitial migration of effector CD4(+) T cells is dependent on integrin αv. Nat Immunol. 14 (9), 949-958 (2013).
