여기에서는 감염 중 병원성 박테리아를 장기 전체에서 검출하고 형광 리포터 활동을 정량화할 수 있는 절차에 대해 설명합니다.
대부분의 감염은 복잡한 해부학적 구조와 국소적으로 다양한 숙주 생리학을 가진 3차원 숙주 조직 내에서 발생합니다. 이러한 다양한 환경 내에서 병원체 세포의 위치는 스트레스 수준, 반응, 운명 및 질병 및 치료 실패의 전반적인 진행에 대한 기여도에 큰 영향을 미칩니다. 그러나 cm 크기의 숙주 기관 내에서 μm 크기의 병원체 세포를 찾는 기술적 어려움으로 인해 이 연구 분야는 상대적으로 탐구되지 않았습니다. 여기에서는 이 문제를 해결하는 방법을 제시합니다. 우리는 연속 이광자 단층 촬영과 AI 강화 이미지 분석을 사용하여 감염된 마우스의 전체 비장, 간엽 및 전체 림프절에서 개별 살모넬라 세포를 찾습니다. 형광 리포터와 in vivo 항체 투여를 사용하여 단일 살모넬라 세포의 복제 속도, 특정 면역 세포와의 국소 상호 작용 및 항생제에 대한 박테리아 반응을 결정할 수 있습니다. 이러한 방법론은 3차원 조직 맥락 내에서 감염, 예방 및 치료에 대한 포괄적인 검사를 위한 길을 열어줍니다.
감염은 복잡한 해부학적 구조와 구획화된 생리학을 가진 조직에서 발생합니다. 감염된 조직에 공존하는 다양한 미세환경은 국소 병원체 하위 집합의 운명과 전체 질병 결과에 대한 기여도를 결정할 수 있습니다 1,2,3. 그러나 cm 크기의 조직에서 미생물 병원체에 대한 포괄적인 3D 매핑은 여전히 어려운 과제로 남아 있습니다4. 뇌 및 기타 장기의 이미징은실험 전략5을 지속적으로 개선하는 매우 활발한 연구 분야이지만, 많은 방법은 여전히 μm 크기의 박테리아 병원체를 자신 있게 식별하는 데 필요한 μm 미만의 해상도가 부족합니다. 이와 대조적으로, 연속 이광자(STP) 단층 촬영6은 μm 미만의 면내 해상도로 전체 조직의 자동화된 다중 색상, 변형 없는 이미징을 가능하게 하여 전체 체적 데이터 세트를 생성합니다. 이 방법은 진동체를 사용하여 조직의 반복적인 물리적 절편과 적외선으로 떠오르는 블록 면의 간헐적인 이광자 이미징을 결합합니다. STP 단층 촬영은 연결성 맵 7,8,9,10을 설정하기 위해 뇌의 얇은 축삭을 매핑하는 데 널리 사용되었습니다.
STP 단층 촬영은 또한 단층 촬영을 사용하여 전체 감염 조직11,12에서 개별 미생물 병원체 세포(살모넬라, 톡소플라즈마)의 3D 매핑을 가능하게 합니다. 2차 조화 생성은 동맥 주위와 비장의 섬유주와 같은 섬유질 띠에서 콜라겐 덮개를 드러내어 해부학적 맥락을 제공합니다. In vivo 주입 형광 항체는 개별 병원체 세포와 호중구와 같은 침윤 면역 세포 간의 상호 작용을 밝히기 위해 숙주 세포를 염색하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 조직 처리, 이미징, 조명 보정을 통한 이미징 타일 스티칭, 3차원 이미지 적층 및 기계 학습 도구를 사용한 분할과 관련된 파이프라인에 대해 설명합니다. 이 파이프라인은 호스트 컨텍스트 내에서 개별 병원체, 세포 및 미세 콜로니의 3D 위치를 생성합니다. 미세콜로니 내의 개별 세포의 수를 세는 것은 해상도 한계 때문에 여전히 어렵지만, 이러한 숫자는 미세콜로니의 통합 밝기를 기반으로 추정할 수 있습니다. 파이프라인은 재조합 GFP 또는 YFP 발현 병원체를 사용할 수 있는 경우 다른 감염 모델에 쉽게 적용할 수 있습니다.
세균 병원체의 국소 조직 맥락은 국소 숙주 공격, 세균 적응, 숙주 병원체 상호 작용 및 항균 화학 요법의 국소적 결과, 전체 질병 결과에 대한 개별 기여도를 결정하는 데 중요합니다. 센티미터 크기의 장기에서 마이크로미터 크기의 박테리아를 이미징하는 것은 어려운 일이었습니다. 연속 이광자(STP) 단층 촬영은 전체 장기에서 개별 박테리아 세포를 검출할 수 있는 충분한 공간 해상도, 자동화된 절편 및 이미징, 충분한 처리량(하루에 ~1개의 장기)을 제공합니다11. 숙주 항원은 in vivo에서 염색할 수 있지만, 병원체 세포는 세포 내 병원체 세포를 종합적으로 검출할 수 있도록 적절한 형광 단백질을 발현해야 합니다. 결과 데이터 세트(장기당 0.5-1.5테라바이트)는 데이터 분석 및 저장을 위한 IT 인프라에 상당한 문제를 제기합니다.
이 방법에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 형광 단백질 GFP 또는 YFP의 검출 가능하고 균일한 발현을 가진 병원체 균주가 필요합니다. 이상적으로는, 염색체 발현 카세트(25 )를 사용하여 플라스미드 복제수 변이로 인한 형광 이질성을 최소화합니다. 충분한 형광 강도가 필요하지만 병원체(23)의 체력 장애를 피하기 위해 과도한 수준의 형광 단백질은 피해야 한다. 적절한 발현 수준은 적절한 프로모터의 선택 및 리보솜 결합 부위(25 ) 또는 전체 5′ 번역되지 않은 영역(UTR)(26)의 미세 조정에 의해 얻어질 수 있다. 둘째, 관류 고정에는 혈액 순환에서 가능한 한 많은 적혈구를 제거하기 위해 완충액으로 초기 세척이 포함되어야 합니다. 이는 비장과 간에 특히 중요합니다(이러한 기관에서 적혈구를 완전히 제거하는 것은 어렵지만). 나머지 적혈구는 스펙트럼의 가시광선 부분에서 빛을 흡수하여 이미징 품질을 저하시킨다27. 셋째, 동결보호제에 고정된 조직을 보관하는 것은 염증 조직에서 특히 높고 병원체 세포의 상대적으로 약한 형광을 가려줄 수 있는 조직 자가형광을 줄이는 데 중요하다11. 넷째, 조직을 주변 아가로스 블록과 효과적으로 가교하는 것은 조직이 아가로스 블록에서 튀어나오지 않고 부드러운 비브라톰 절단에 중요합니다. 다섯째, 형광 신호와 병원체 세포로서의 식별은 병원체 성분에 대한 항체(예: 그람 음성 세균에 대한 지질다당류)로 염색하고 단층검사에서 검색한 절편의 컨포칼 현미경과 같은 직교 접근법을 사용하여 독립적으로 검증해야 합니다11. 일부 감염된 조직에는 병원체 세포로 쉽게 오인될 수 있는 유사한 모양과 겹치는 형광 스펙트럼을 가진 자가형광 입자가 포함되어 있습니다. 여섯째, 미세콜로니 내 병원체 세포의 양을 공초점 현미경과 같은 직교 접근법과 비교하여 정확도를 평가해야 합니다. 이러한 계산을 기반으로 한 전체 박테리아 부하는 유세포 분석 및 도금과 같은 직교 접근법과 비교하여 검증해야 합니다.
널리 사용되는 STP 프로토콜의 중요한 수정 사항에는 감염 및 염증이 있는 간, 비장 및 Peyer’s patch에서 특히 강한 녹색-노란색 자가형광의 간섭을 줄이기 위해 광전자 증배관 211 앞에 협대역 통과 필터 510/20nm를 배치하는 것이 포함됩니다. 뇌(STP의 다른 응용 분야를 지배함)에 비해 이러한 장기의 강력한 자가형광 및 증가된 광 산란은 또한 불균일한 조명에 대한 보다 효과적인 보정이 필요합니다. 또 다른 수정 사항으로, 이 프로토콜은 이러한 목적을 위해 CIDRE 접근법22 (그림 3)와 박테리아의 AI 기반 세분화를 사용합니다. 마지막으로, -20°C에서 동결보호제에 배양 단계를 포함하여 조직 자가형광을 감소시켜 상대적으로 형광이 약한 작은 병원체 세포의 검출을 용이하게 함으로써 조직 전처리를 변경했습니다11.
병원체 신호를 감지할 수 없거나 세분화로 인해 감도가 충분하지 않거나(너무 많은 병원체 세포가 누락됨) 정밀도가 충분하지 않는(너무 많은 배경 입자가 병원체 세포로 분할됨) 문제 해결이 필요할 수 있습니다. 배경 조직 자가형광을 검출할 수 있지만 병원체 신호가 너무 적으면 병원체에 형광 단백질이 충분하지 않을 수 있습니다. 이는 동일한 감염된 조직의 조직 절편을 컨포칼 현미경으로 검사하거나 조직 균질체19,28의 유세포 분석을 사용하여 테스트할 수 있습니다. 근본적인 원인은 불충분한 발현 수준 또는 익스프레션 카세트의 불안정성일 수 있습니다. 완화 전략에는 발현을 유도하는 대체 프로모터, 병원체 종에 대한 형광 단백질을 암호화하는 유전자의 코돈 적응, 복제 수가 더 높은 에피솜 구조체의 사용, 염색체 통합 또는 균형 치사 보완에 의한 발현 카세트의 안정화가 포함될 수 있습니다29. 형광 단백질의 선택도 중요하지만 GFP.mut2, mWasabi, YPet 및 TIMERbac으로 검출이 가능합니다. 분할이 정확하지 않은 경우, 이는 위에서 설명한 대로 해결할 수 있는 너무 약한 병원체 형광 또는 너무 높은 조직 자가형광 배경이 원인일 수 있습니다. 세척 용액을 광범위하게 관류하거나 아가로스 블록 및 단층 촬영에 삽입하기 직전에 저장 완충액에서 장기간 배양하면 이러한 문제를 해결할 수 있습니다. 마지막으로, 정확한 분류를 위해서는 신경망에 대한 충분한 훈련이 필요하지만, 과도한 훈련은 새로운 샘플에 대한 성능을 저하시키는 과적합으로 이어질 수 있습니다.
현재 다른 어떤 방법도 개별 박테리아를 검출하기 위해 3D로 충분한 공간 해상도로 전체 장기를 이미지화할 수 없습니다. 조직 투명화 및 광시트 현미경 검사의 향후 개선으로 유사한 해상도를 달성할 수 있습니다. 이를 통해 더 빠른 속도와 더 많은 형광 채널로 이미징할 수 있습니다.
STP의 중요한 제한 사항은 ~0.5 μm의 평면 내 픽셀 해상도와 5 – 10 μm의 수직 해상도로, 예를 들어 조밀하게 밀집된 미세콜로니 내에 밀접하게 위치한 박테리아를 해결하기에는 충분하지 않습니다. 그러나 선택한 조직 부분의 2차 고해상도 컨포칼 현미경 검사를 위해 단층 촬영 후 조직 절편을 회수할 수 있습니다. STP의 또 다른 한계는 3개의 형광 채널만 사용할 수 있다는 것인데, 이는 동시에 이미징할 수 있는 형광단의 수를 제한합니다. 다시 말하지만, 멀티플렉싱 방법을 사용하여 검색된 조직 절편의 2차 분석은 선택한 조직 부분에 대한 더 많은 마커의 위치와 강도를 밝힐 수 있습니다. 이 정보는 STP로 결정된 대로 주변 조직의 전체 3D 구조에 통합될 수 있습니다.
결론적으로, 이 프로토콜은 국소 및 전체 장기 수준에서 숙주-병원체 상호 작용에 대한 자세한 조사를 가능하게 합니다. 프로토콜은 다른 병원체(형광 균주로 얻을 수 있는 경우), 다른 장기 및 다른 숙주 종에 쉽게 적용할 수 있어야 합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 스위스 국립과학재단(Swiss National Science Foundation) 310030_156818, 310030_182315 및 NCCR_ 180541 AntiResist(to DB)의 지원을 받았다.
Chemicals | |||
Agarose Low Melt | Roth | Art. 6351.5 25g | |
Boric acid | Sigma-Aldrich | 6768-500G | |
Instant adhesive Loctite 435 | Henkel | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | P5413-1kg | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP-100G | |
Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 71321-25g | |
Sodium hydroxide | Merck | 106453 | |
Sodium periodate | Sigma-Aldrich | 311448-100G | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640-250G | |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71500-1KG | |
Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732-100g | |
Sucrose | AppliChem | A4734,1000 | |
Tris-buffered saline (TBS) | Merck | T5912-1L | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
Vacuum filtration 500 | TPP | TPP99250 | |
Equipment | |||
Blade | Campden Instruments Limited | 01-01-4692 | |
MAITAI Laser | Spectra-Physics | ||
Peel away plastic mold | Sigma-Aldrich | E6032-1CS | |
TissueCyte 1000 tomograph | TissueVision | ||
Antibody/dyes | |||
DAPI | Merck | D9542-5MG | |
Primary antibodies | |||
anti-LPS Salmonella, rabbit | Sifin | REF TS 1624 | |
anti-CD169-PE, clone 3D6.112 | Biolegend | 142403 | |
anti-Ly-6G-PE, clone 1A8 | Biolegend | 127608 | |
Secondary antibodies | Invitrogen | ||
chicken anti-rabbit Alexa 647 | Invitrogen | A-21443 | |
Software | Company | Version | |
Fiji | Image J | 1.54g or later | |
MATLAB | MathWorks | 2017b/2018b or later | |
Orchestrator (tomograph) | TissueVision | ||
Visualization software Imaris | Oxford Instruments | 9.9.0 or later |