במאמר זה אנו מתארים הליך המאפשר זיהוי כלל איברי של חיידקים פתוגניים במהלך ההדבקה וכימות של פעילות המדווח הפלואורסצנטי.
רוב הזיהומים מתרחשים בתוך רקמות מארח תלת מימדיות עם אנטומיה מורכבת ופיזיולוגיה מקומית משתנה של המארח. מיקומם של תאי פתוגן בסביבה מגוונת זו משפיע באופן משמעותי על רמות הלחץ שלהם, תגובותיהם, גורלם ותרומתם להתקדמות הכוללת של המחלה ולכישלון הטיפול. עם זאת, בשל הקשיים הטכניים באיתור תאי פתוגן בגודל מיקרומטר בתוך איברים מארחים בגודל ס”מ, תחום מחקר זה כמעט ולא נחקר. כאן אנו מציגים שיטה להתמודדות עם אתגר זה. אנו משתמשים בטומוגרפיה סדרתית של שני פוטונים ובניתוח תמונה משופר באמצעות בינה מלאכותית כדי לאתר תאי סלמונלה בודדים בכל הטחול, אונות הכבד ובלוטות הלימפה השלמות של עכברים נגועים. באמצעות כתבים פלואורסצנטיים ומתן נוגדנים in vivo , ניתן לקבוע את קצב השכפול של תאי סלמונלה בודדים, את האינטראקציה המקומית שלהם עם תאי חיסון ספציפיים ואת תגובות החיידקים לאנטיביוטיקה. מתודולוגיות אלו פותחות אפיקים לבחינה מקיפה של זיהומים, מניעתם והטיפול בהם בהקשר התלת-ממדי של הרקמה.
זיהומים מתרחשים ברקמות עם אנטומיה מורכבת ופיזיולוגיה ממודרת. המיקרו-סביבות המגוונות המתקיימות יחד ברקמה הנגועה יכולות לקבוע את גורלן של תת-קבוצות פתוגנים מקומיות ואת תרומתן לתוצאה הכוללת של המחלה 1,2,3. עם זאת, מיפוי תלת-ממדי מקיף של פתוגנים מיקרוביאליים ברקמות בגודל ס”מ נותר מאתגר4. הדמיה של המוח ואיברים אחרים היא תחום מחקר פעיל מאוד עם שיפור מתמיד של אסטרטגיות ניסוי5, אך שיטות רבות עדיין חסרות את הרזולוציה תת-מיקרומטר שתידרש כדי לזהות פתוגנים חיידקיים בגודל מיקרומטר בביטחון. לעומת זאת, טומוגרפיה טורית של שני פוטונים (STP)6 מאפשרת הדמיה אוטומטית מרובת צבעים ונטולת עיוותים של רקמות שלמות ברזולוציה תת-מיקרומטרית במישור, ומניבה מערכי נתונים נפחיים מלאים. שיטה זו משלבת חתך פיזי חוזר ונשנה של הרקמה באמצעות ויברטום, עם הדמיה לסירוגין של שני פוטונים של פני הבלוק המתהווים עם אור אינפרא אדום. טומוגרפיית STP נמצאת בשימוש נרחב למיפוי אקסונים דקים במוח כדי ליצור מפות קישוריות 7,8,9,10.
טומוגרפיית STP מאפשרת גם מיפוי תלת ממדי של תאי פתוגן מיקרוביאליים בודדים (סלמונלה, טוקסופלסמה) בכל הרקמות הנגועות11,12 באמצעות טומוגרף. הדור השני-הרמוני חושף את מעטה הקולגן סביב העורקים וברצועות סיביות כגון טרבקולה של הטחול, ובכך מספק הקשר אנטומי. ניתן להשתמש בנוגדנים פלואורסצנטיים מוזרקים In vivo כדי להכתים תאים מארחים ולחשוף אינטראקציות בין תאי פתוגן בודדים לבין תאים חיסוניים חודרים כגון נויטרופילים. כאן מתואר הצינור הכולל עיבוד הרקמה, הדמיה, תפירה של אריחי הדמיה עם תיקון תאורה, ערימה של תמונות בתלת מימד וסגמנטציה באמצעות כלי למידת מכונה. צינור זה מניב מיקומים תלת-ממדיים של פתוגנים, תאים ומיקרו-מושבות בודדים בהקשר המארח שלהם. ספירת מספר התאים הבודדים בתוך מיקרו-מושבות נותרה קשה בגלל מגבלות רזולוציה, אך ניתן להעריך מספרים כאלה בהתבסס על הבהירות המשולבת של המיקרו-מושבה. ניתן להתאים את הצינור בקלות למודלים אחרים של זיהום אם פתוגנים מבטאי GFP או YFP רקומביננטיים זמינים.
ההקשר הרקמתי המקומי של פתוגנים חיידקיים חיוני לקביעת התקפות מארח מקומיות, התאמות חיידקיות, התוצאה המקומית של אינטראקציות הפתוגן המארח וכימותרפיה מיקרוביאלית, והתרומה האישית לתוצאה הכוללת של המחלה. הדמיה של חיידקים בגודל מיקרומטר באיברים בגודל סנטימטרים הייתה מאתגרת. טומוגרפיה טורית של שני פוטונים (STP) מספקת רזולוציה מרחבית מספקת כדי לזהות תאי חיידקים בודדים באיברים שלמים, חתך והדמיה אוטומטיים, ותפוקה מספקת (~ איבר אחד ליום)11. בעוד אנטיגנים מארח יכול להיות מוכתם in vivo, תאים פתוגניים צריכים לבטא חלבונים פלואורסצנטיים מתאימים כדי להבטיח זיהוי מקיף של תאים פתוגניים תאיים. מערכי הנתונים המתקבלים (0.5-1.5 טרה-בייט לכל איבר) מציבים אתגרים משמעותיים בפני תשתיות IT לניתוח ואחסון נתונים.
ישנם מספר שלבים קריטיים בשיטה זו. ראשית, נדרש זן פתוגן עם ביטוי ניתן לזיהוי והומוגנית של חלבון פלואורסצנטי GFP או YFP. באופן אידיאלי, קלטת ביטוי כרומוזומלית25 משמשת כדי למזער הטרוגניות פלואורסצנטית עקב וריאציה של מספר העתק פלסמיד. נדרשת עוצמה פלואורסצנטית מספקת, אך יש להימנע מרמות מוגזמות של חלבון פלואורסצנטי כדי למנוע ליקויי כושר של הפתוגן23. ניתן לקבל רמות ביטוי מתאימות על ידי בחירת מקדם מתאים וכוונון עדין של אתר הקישור הריבוזומלי25 או כל האזור הלא מתורגם (UTR) 5′ 26. שנית, קיבוע הזלוף צריך לכלול שטיפה ראשונית עם חיץ כדי להסיר כמה שיותר אריתרוציטים ממחזור הדם. זה קריטי במיוחד עבור הטחול והכבד (אם כי הסרה מלאה של אריתרוציטים מאיברים אלה קשה). אריתרוציטים נותרים בולעים אור בחלק הנראה של הספקטרום ופוגעים באיכות ההדמיה27. שלישית, אחסון הרקמות הקבועות בהגנה הקפויה הוא קריטי להפחתת הפלואורסצנטיות של הרקמות, שהיא גבוהה במיוחד ברקמות דלקתיות ויכולה להאפיל על הפלואורסצנטיות החלשה יחסית של תאי הפתוגן11. רביעית, הקישור הצולבות היעיל של הרקמה לגוש האגרוז שמסביב הוא קריטי לחיתוך ויברטומי חלק מבלי שהרקמה תקפוץ החוצה מגוש האגרוז. חמישית, אותות פלואורסצנטיים וזיהויים כתאי פתוגן חייבים להיות מאומתים באופן עצמאי באמצעות גישות אורתוגונליות כגון צביעה בנוגדנים לרכיבים פתוגניים (כגון ליפופוליסכריד לחיידקים גראם-שליליים) ומיקרוסקופ קונפוקלי של המקטעים שנשלפו מטומוגרף11. חלק מהרקמות הנגועות מכילות חלקיקים פלואורסצנטיים אוטומטיים בעלי צורה דומה וספקטרום פלואורסצנטי חופף שניתן לפרש בקלות בטעות כתאי פתוגן. שישית, יש להשוות את כמות התאים הפתוגניים בתוך מיקרו-מושבות לגישות אורתוגונליות כגון מיקרוסקופ קונפוקלי כדי להעריך את הדיוק. יש לאמת את העומסים החיידקיים הכוללים המבוססים על חישובים אלה בהשוואה לגישות אורתוגונליות כגון ציטומטריית זרימה וציפוי.
שינויים חשובים בפרוטוקול STP הנמצא בשימוש נרחב כוללים הצבת מסנן פס צר 510/20 ננומטר לפני מכפיל אור 211, כדי להפחית את ההפרעה של אוטופלואורסנציה ירוקה-צהובה החזקה במיוחד בכבד, בטחול ובמדבקות פייר נגועות ומודלקות. האוטופלואורסצנטיות החזקה ופיזור האור המוגבר של איברים כאלה בהשוואה למוח (השולט ביישומים אחרים של STP) יוצרים גם צורך בתיקון יעיל יותר להארה לא אחידה. כשינוי נוסף, פרוטוקול זה משתמש בגישת CIDRE22 למטרה זו (איור 3) ופילוח מבוסס בינה מלאכותית של חיידקים. לבסוף, עיבוד מקדים של רקמות השתנה על ידי הכללת שלב הדגירה בהגנה קריופרוטקטורית ב -20 °C אשר מפחית את autofluorescence רקמות ובכך מקל על זיהוי של תאים פתוגניים קטנים עם פלואורסצנטיות חלשה יחסית11.
פתרון בעיות עשוי להיות נחוץ אם לא ניתן לזהות אותות פתוגנים, או שסגמנטציה מניבה רגישות לא מספקת (יותר מדי תאי פתוגן מתפספסים) או דיוק לא מספיק (יותר מדי חלקיקי רקע מפולחים כתאי פתוגן). אם ניתן לזהות אוטופלואורסצנטיות של רקמת הרקע אך יש מעט מדי אותות פתוגנים, הפתוגנים עשויים להכיל כמויות לא מספיקות של חלבונים פלואורסצנטיים. ניתן לבדוק זאת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של חלקי רקמה מאותה רקמה נגועה או ציטומטריית זרימה של הומוגנטים ברקמה19,28. סיבות בסיסיות יכולות להיות רמות ביטוי לא מספיקות או חוסר יציבות של קלטת הביטוי. אסטרטגיות הפחתה יכולות לכלול מקדמים חלופיים להנעת ביטוי, התאמת קודון של הגנים המקודדים את החלבון הפלואורסצנטי עבור מיני הפתוגנים, שימוש במבנים אפיזומליים עם מספר העתקים גבוה יותר, או ייצוב קלטות ביטוי על ידי אינטגרציה כרומוזומלית או השלמה מאוזנת-קטלנית29. הבחירה בחלבון פלואורסצנטי חשובה גם היא, אך זיהוי אפשרי באמצעות GFP.mut2, mWasabi, YPet ו-TIMERbac. אם הסגמנטציה אינה מדויקת, הדבר עלול להיגרם על ידי פלואורסצנטיות פתוגן חלשה מדי שניתן לטפל בה כמתואר לעיל, או רקע אוטופלואורסצנטי גבוה מדי ברקמות. זילוח נרחב של תמיסת שטיפה או דגירה ממושכת במאגר האחסון מיד לפני ההטבעה בבלוק האגרוז ובטומוגרפיה עשויים לפתור בעיות אלה. לבסוף, נדרש אימון מספיק של הרשת העצבית לסיווג מדויק, אך אימון מוגזם עלול להוביל להתאמת יתר הפוגעת בביצועים של דגימות חדשות.
כיום, אין שיטה אחרת שיכולה לצלם איברים שלמים ברזולוציה מרחבית מספקת בתלת-ממד לאיתור חיידקים בודדים. שיפורים עתידיים בניקוי רקמות ומיקרוסקופ יריעות אור עשויים להשיג רזולוציה דומה. זה עשוי לאפשר הדמיה במהירות גבוהה יותר ועם יותר תעלות פלואורסצנטיות.
מגבלה חשובה של STP היא רזולוציית הפיקסלים במישור של ~0.5 מיקרומטר ורזולוציה אנכית של 5 עד 10 מיקרומטר, שאינה מספיקה לפתרון חיידקים הממוקמים קרוב, למשל, בתוך מיקרו-מושבה צפופה. עם זאת, ניתן לאחזר קטעי רקמות לאחר טומוגרפיה עבור מיקרוסקופ קונפוקלי משני ברזולוציה גבוהה של חלקי רקמה נבחרים. מגבלה נוספת של STP היא זמינותם של שלושה תעלות פלואורסצנטיות בלבד, המגבילות את מספר הפלואורופורים שניתן לצלם בו זמנית. שוב, ניתוח משני של קטעי רקמה שאוחזרו בשיטות ריבוב יכול לחשוף את המיקום והעוצמה של סמנים רבים נוספים עבור חלקי רקמה נבחרים. מידע זה יכול להיות משולב במבנה התלת-ממדי הכולל של הרקמה הסובבת כפי שנקבע באמצעות STP.
לסיכום, פרוטוקול זה מאפשר חקירות מפורטות של אינטראקציות מארח-פתוגן ברמה המקומית וברמת האיבר כולו. הפרוטוקול צריך להיות ניתן להתאמה בקלות לפתוגנים אחרים (בתנאי שניתן להשיג אותם כזנים פלואורסצנטיים), איברים אחרים ומינים מארחים שונים.
The authors have nothing to disclose.
העבודה נתמכה על ידי הקרן הלאומית השוויצרית למדע 310030_156818, 310030_182315 ו-NCCR_ 180541 AntiResist (ל-DB).
Chemicals | |||
Agarose Low Melt | Roth | Art. 6351.5 25g | |
Boric acid | Sigma-Aldrich | 6768-500G | |
Instant adhesive Loctite 435 | Henkel | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | P5413-1kg | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP-100G | |
Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 71321-25g | |
Sodium hydroxide | Merck | 106453 | |
Sodium periodate | Sigma-Aldrich | 311448-100G | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640-250G | |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71500-1KG | |
Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732-100g | |
Sucrose | AppliChem | A4734,1000 | |
Tris-buffered saline (TBS) | Merck | T5912-1L | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
Vacuum filtration 500 | TPP | TPP99250 | |
Equipment | |||
Blade | Campden Instruments Limited | 01-01-4692 | |
MAITAI Laser | Spectra-Physics | ||
Peel away plastic mold | Sigma-Aldrich | E6032-1CS | |
TissueCyte 1000 tomograph | TissueVision | ||
Antibody/dyes | |||
DAPI | Merck | D9542-5MG | |
Primary antibodies | |||
anti-LPS Salmonella, rabbit | Sifin | REF TS 1624 | |
anti-CD169-PE, clone 3D6.112 | Biolegend | 142403 | |
anti-Ly-6G-PE, clone 1A8 | Biolegend | 127608 | |
Secondary antibodies | Invitrogen | ||
chicken anti-rabbit Alexa 647 | Invitrogen | A-21443 | |
Software | Company | Version | |
Fiji | Image J | 1.54g or later | |
MATLAB | MathWorks | 2017b/2018b or later | |
Orchestrator (tomograph) | TissueVision | ||
Visualization software Imaris | Oxford Instruments | 9.9.0 or later |