Summary

Estimación de la sensibilidad estructural de regiones intrínsecamente desordenadas en respuesta al estrés hiperosmótico en células vivas mediante FRET

Published: January 12, 2024
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Summary

Las regiones intrínsecamente desordenadas (IDR) son dominios proteicos flexibles que modifican su conformación en respuesta a los cambios ambientales. La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de conjunto (FRET) puede estimar las dimensiones de las proteínas en diferentes condiciones. Presentamos un enfoque FRET para evaluar la sensibilidad estructural de IDR en células vivas de Saccharomyces cerevisiae bajo estrés hiperosmótico.

Abstract

Las regiones intrínsecamente desordenadas (IDR, por sus siglas en inglés) son dominios proteicos que participan en procesos celulares cruciales. Durante las condiciones de estrés, las propiedades fisicoquímicas del entorno celular cambian, lo que afecta directamente al conjunto conformacional de las IDR. Los exámenes exhaustivos son inherentemente sensibles a las perturbaciones ambientales. El estudio de cómo las propiedades fisicoquímicas de la célula regulan el conjunto conformacional de las IDR es esencial para comprender el control ambiental de su función. Aquí, describimos un método paso a paso para medir la sensibilidad estructural de las IDR en células vivas de Saccharomyces cerevisiae en respuesta a condiciones de estrés hiperosmótico. Presentamos el uso de la transferencia de energía por resonancia fluorescente de conjunto (FRET) para estimar cómo cambian las dimensiones globales de las IDR durante un aumento progresivo del estrés hiperosmótico impuesto a las células con cualquier osmolito. Además, proporcionamos un script para procesar las mediciones de fluorescencia y comparar la sensibilidad estructural para diferentes IDR. Siguiendo este método, los investigadores pueden obtener información valiosa sobre los cambios conformacionales que experimentan las IDR en el complejo entorno intracelular al cambiar de entorno.

Introduction

Las regiones intrínsecamente desordenadas (IDR) son componentes críticos en los procesos celulares1. En combinación con los dominios estructurados, los IDR son esenciales para las funciones de las proteínas. La composición de aminoácidos de los IDR está sesgada, representada principalmente por residuos cargados, hidrófilos y pequeños. Debido a esta propiedad, los IDR se consideran dominios de baja complejidad 2,3. Numerosas IDR han atraído la atención, principalmente porque estas regiones juegan un papel crucial en las condiciones patológicas, particularmente las enfermedades neurodegenerativas. Estas enfermedades se caracterizan por el autoensamblaje y el posterior depósito extracelular o intracelular de IDR en las neuronas4. Ejemplos de tales IDR incluyen amiloide-β (Aβ) en la enfermedad de Alzheimer, huntingtina (HTT) en la enfermedad de Huntington y proteína de unión al ADN-43 de TAR (TDP-43) y fusionada en el sarcoma (FUS) en la esclerosis lateral amiotrófica y la demencia frontotemporal4. El estudio de los reordenamientos estructurales de las IDR en el contexto de la enfermedad se ha mejorado significativamente mediante métodos espectroscópicos, incluida la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET).

La naturaleza hidrofílica y extendida de los IDR los hace extremadamente sensibles a los cambios en las propiedades fisicoquímicas del entorno de la solución5. El grado en que el conjunto conformacional de IDR es modificado por el medio ambiente se denomina sensibilidad estructural 5,6,7. Se pueden utilizar diferentes técnicas para estudiar la conformación y la dinámica de las IDR, incluyendo el dicroísmo circular (CD) y la dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS)8,9. Desafortunadamente, la CD y el SAXS requieren grandes cantidades de proteínas purificadas, por lo que no son apropiados para estudios en células. Por el contrario, FRET es una técnica que mide la intensidad de fluorescencia de dos moléculas fluorescentes que marcan específicamente una IDR, lo que significa que pueden ser monitoreadas en mezclas complejas como las células vivas10. La medición dinámica de la sensibilidad estructural de las IDR en células vivas es necesaria para comprender cómo el entorno regula la conformación y la función del proteoma desordenado.

FRET es un método potente para cuantificar la sensibilidad estructural de las IDR, así como de las proteínas globulares y multidominio en células vivas. El método requiere una construcción que consiste en un IDR de interés intercalado entre dos proteínas fluorescentes (FP), conocido como par FRET. Para este protocolo, sugerimos el uso de mCerulean3 como FP donante y Citrino como FP aceptor, debido a su amplio rango dinámico, en comparación con otros MF reportados en un estudio previo sobre la sensibilidad de lasIDRs 6. La FRET se ha explotado previamente para medir la sensibilidad estructural de una IDR de una planta en diferentes contextos celulares6. Además, esta técnica ha sido utilizada para caracterizar las dimensiones proteicas globales de las IDR por diferentes grupos de investigación tanto in vitro como in vivo 5,11.

Aquí, describimos el método FRET de conjunto para estudiar la sensibilidad estructural de las IDR en células vivas de levadura (Saccharomyces cerevisiae). Mostramos resultados representativos que se basan en una IDR de planta llamada AtLEA4-5. AtLEA4-5 está desordenada en solución, pero se pliega en α-hélice cuando se induce el hacinamiento macromolecular in vitro12. AtLEA4-5 es un buen modelo de referencia para este método porque es relativamente pequeño (158 residuos), desordenado y sensible a la perturbación ambiental como se ha reportado in silico e in vitro 6,12. El método presentado aquí se puede escalar para enfoques de alto rendimiento porque las células de levadura son fáciles de cultivar y el tratamiento se aplica en pequeños volúmenes. Además, pequeñas modificaciones del protocolo pueden aplicarse a otros sistemas celulares como bacterias y células vegetales6. El protocolo se puede realizar en cualquier laboratorio de biología molecular con acceso a un lector de microplacas con modo fluorescencia, un equipo disponible en la mayoría de las instituciones de investigación.

Protocol

1. Construcción de plásmido Amplifique el marco de lectura abierto (ORF) que codifica la IDR deseada mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). No incluya el codón de parada, ya que el ORF estará flanqueado por los genes que codifican las proteínas fluorescentes. Para la amplificación, diseñe cebadores con los sitios de restricción SacI (5′) y BglII (3′).NOTA: Para la sección de resultados representativos, utilizamos AtLEA4-5 como IDR seleccionado. Am…

Representative Results

Después de transformar las células de levadura con el plásmido pDRFLIP38-AtLEA4-5, se observó la fluorescencia de los transformantes positivos con un transiluminador de luz azul y un filtro (Figura 1). La preparación de las diferentes soluciones para inducir el estrés hiperosmótico requiere mucho tiempo, por lo que sugerimos seguir la plantilla de 96 pocillos de la Figura 2. Inmediatamente después del tratamiento de estrés hiperosmótico con concentraci…

Discussion

El método que aquí se presenta ofrece una forma de obtener información sobre cómo las dimensiones globales del conjunto de exámenes exhaustivos detectan y responden a las perturbaciones ambientales. Este método se basa en una construcción codificada genéticamente y no requiere componentes adicionales más allá de una expresión estable de plásmido en células de levadura, lo que lo hace adaptable para aplicaciones potenciales en otros tipos de células. Además, es versátil para explorar otras perturbaciones f…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a los miembros del laboratorio Cuevas-Velázquez por la revisión crítica del manuscrito. Este trabajo contó con el apoyo del Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica, Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM-PAPIIT) proyecto número IA203422; Consejo Nacional de Humanidades, Ciencias y Tecnología (CONAHCYT), proyecto número 252952; y Programa de Apoyo a la Investigación y el Posgrado, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México, Subvención 5000-9182. CET (CVU 1083636) y CAPD (CVU 1269643) reconocen a CONAHCYT por su M.Sc. Beca.

Materials

96-well plate Greiner Bio-One 655096
Agar Sigma-Aldrich 5040
BglII New England BioLabs R0144S
BJ5465 cells American Type Culture Collection 208289
Buffer MES 50 mM Sigma-Aldrich M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM Invitrogen 15506017
EDTA 1 mM Merck 108452
Falcon tubes Corning 352057
LB media Sigma-Aldrich L2897
Lithium acetate 0.1 M Sigma-Aldrich L6883
Low Melt Agarose GOLDBIO A-204-25
Microcentrifuge eppendorf 5452000010
Miniprep kit ZymoPure D4210
NaOH 0.02 M Merck 106462
PEG 3,350 40% Sigma-Aldrich 1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5 addgene 178189
Plate reader BMG LABTECH CLARIOstar Plus
SacI New England BioLabs R3156S
Salmon sperm DNA 2 mg/mL Thermo Fisher Scientific 15632011
SD-Ura Sigma-Aldrich Y1501
Sodium cloride Sigma-Aldrich S9888
Taq polymesare Promega M5123
Transiluminator Accuris instruments E4000
UV-Visible spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Biomate3
YPD media Sigma-Aldrich Y1500

Referencias

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Citar este artículo
Enriquez-Toledo, C., Ponce-Diego, C. A., Cuevas-Velazquez, C. L. Estimation of Structural Sensitivity of Intrinsically Disordered Regions in Response to Hyperosmotic Stress in Living Cells Using FRET. J. Vis. Exp. (203), e66275, doi:10.3791/66275 (2024).

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