Summary

クライオセクショニングによる脳定位固定装置注射座標の予備検証

Published: July 19, 2024
doi:

Summary

本プロトコルは、色素および凍結切片を用いてウイルス追跡を行う前に、脳定位固定装置注射座標の検証ステップを迅速化するための実際的な戦略を説明しています。

Abstract

特定の脳領域の定位固定装置注射は、基礎神経科学における基本的な実験手法を構成しています。研究者は通常、マウスの脳アトラスや、さまざまな集団/年齢のマウス、さまざまな定位固定装置を使用した公開資料に基づいて定位固定装置注射パラメータを選択するため、定位固定装置の座標パラメータをさらに検証する必要があります。カルシウムイメージング、化学遺伝学、および光遺伝学的操作の有効性は、関心領域内のレポーター遺伝子の正確な発現に依存しており、多くの場合、数週間の努力が必要です。そのため、目的の脳領域の座標を事前に確認しておかないと手間のかかる作業になります。ウイルスの代わりに適切な色素を使用し、クライオセクショニングを実施することで、研究者は色素投与後すぐに注入部位を観察することができます。これにより、実際の注入部位と理論上の位置との間に不一致がある場合に、パラメータを調整するためのタイムリーな調整が容易になります。このような調整により、その後の実験における標的領域内でのウイルス発現の精度が大幅に向上します。

Introduction

in vivoカルシウム記録、光遺伝学、化学遺伝学など、現代のほぼすべての神経調節ツールは、脳の関心領域を標的とするために定位固定座標の使用を必要としています1,2,3、神経操作の基礎を形成しています。マウスの脳領域の定位固定装置座標は、頭蓋骨の骨のランドマークであるブレグマとラムダに関連して定義され、いわゆる頭蓋骨由来の定位固定装置座標系を形成します。bregma と lambda のどちらかが 3 次元座標のゼロ点として機能します。3つの軸は、前後軸(AP)、中外側軸(ML)、背腹軸(DV)で、脳定位固定装置のデジタルディスプレイ上のy軸、x軸、z軸を表しています。周知の脳領域については、特定の領域の定位固定座標パラメータは、マウス脳アトラス4(例えば、定位座標におけるPaxinosおよびFranklinのマウス脳)および/または公開された文献5,6から得ることができる。ただし、脳定位固定装置のバリエーションや、研究者によって使用されるマウスの年齢/個体群が異なるため、さらなる検証が必要です。

構造は機能の基本です。神経回路は、認知活動、感情、記憶、感覚、運動機能など、多くの脳機能の基盤を形成しています1。神経回路の構造をラベリングし、その活動を操作することは、特定の神経回路の機能を理解するために不可欠です。過去数十年にわたり、ニューラルトレーサーは何世代にもわたって進化してきました。初期の研究では、前向性トレーサーとして小麦胚芽凝集素(WGA)と尋常性凝集素(PHA)が採用され、逆行性トレーサーとしてフルオロゴールド(FG)、コレラ毒素サブユニットB(CTB)、カルボシアニンが採用されました。しかし、ウイルストレーサーとは異なり、これらの従来のニューラルトレーサーは外因性遺伝子を宿主に組み込むことができず、細胞型選択性も持っていません。今日、ウイルス戦略は基礎神経科学研究における重要な命題となっています。さまざまな研究目的のために、さまざまなウイルスツールを選択できます7,8。非トランスシナプスウイルス、トランスマルチシナプスウイルス(逆行性および前行性)、およびトランスモノシナプスウイルス(逆行性および前行性)があります。各カテゴリには、それぞれの特性を持ついくつかのタイプが含まれています。

ウイルスの投与と発現のプロセスは非常に時間とリソースを大量に消費し、多くの場合、数週間またはそれ以上かかります。様々なウイルスベクターの中で、アデノ随伴ウイルスは遺伝子送達の有望な手段として同定されており、実験手順7,8のために注射後3〜8週間の範囲の広いウィンドウを提供する。AAVが進化するにつれて、投与後2〜3週間で分析を行うことができる9,10。偽狂犬病ウイルス(PRV)や狂犬病ウイルス(RV)などの他の神経回路トレーサーも、少なくとも2〜7日の追跡期間を必要とします11,12,13,14,15。したがって、蛍光シグナルを観察する前に注入部位を事前に検証することは、時間と費用対効果の両方が高いです。

定位固定装置による注射を簡単かつ迅速に検証するために、この研究では、ウイルスベクターの前に色素を投与し、クライオ切片により、研究者は注射部位を観察し、注射後30分以内に追跡することができます。

Protocol

すべての動物実験は、Animal Research Reporting In Vivo Experiments(ARRIVE)ガイドラインおよびNational Institutes of Health Guides for the Care and Use of Laboratory Animalsに準拠して実施されました。本研究は、上海交通大学医学部仁済病院の動物管理および使用委員会によって承認されました。本研究では、生後8週齢のC57BL/6J雄マウスを使用しました。動物は商業的に入手され( 材料の表を参照)、標準的な?…

Representative Results

この研究では、実証された方法を使用して、30分以内に注射部位を特定することに成功しました。最初に、ブロモフェノールブルーを含むSDS-PAGEサンプルローディング溶液をC57/BLマウスのLDTgVに注入しました。 図1A は、色素溶液注入の概略図を示しています。LDTgV中の青色色素の分布を 図1Bに示します。 ブロモフェノールブル?…

Discussion

この記事では、ウイルス追跡の前に脳定位注射5,6の精度をより迅速かつ簡単に検証するための安定した戦略について説明しましたが、脳領域でのレポーター遺伝子発現のかけがえのない側面は、脳領域の標識にとって非常に重要です。使用した青色の染料により、注射部位を即座に視覚化することができました。

このプロトコ…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

中国国家自然科学基金会(XY Sunに助成金NO.82101249)、中国ポスドク研究基金会(XY Sunに助成金NO.2022M722125)。上海セーリングプログラム(SHチェンへの助成金番号21YF1425100)。上海市衛生健康委員会臨床研究特別プロジェクト(J Zhouに助成金NO.202340088)。中国国立自然科学基金会(X Zhangに助成金NO.82101262、SH Chenに助成金NO.82101287)。

Materials

1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3 Hamilton 65458-01
200 μL pipette tips biosharp BS-200-T
20 mL syringe Kindly group
3%H2O2 solution Lircon Company
6-well plate Shengyou Biotech 20006
Anerdian Likang High-tech 31001002
Anti roll plate Leica 14047742497
BD insulin syringe Becton,Dickinson and Company 328421
Bend toothed dissecting forceps Jinzhong JD1050
Cellsens dimension software Olympus
Cotton swab Fisher Scientific 23-400-122
Dapi-Fluoromount-G Southernbiotech 0100-20
Drill Longxiang
Fine brushes HWAHONG
Fine scissors Jinzhong y00030
Fluorescent microscopy Olympus BX63
freezing microtome Leica CM1950
Hemostatic forceps straight with tooth Jinzhong J31010
Infusion needle 0.7 mm Kindly group
Lidocaine hydrochloride injection Harvest Pharmaceutical Company 71230803
Magnifying glass M&G Chenguang Stationery
Male C57/BL mice The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory
Mice coronal brain slice mold RWD Life Science 68713
Microcentrifuge tube biosharp BS-02-P
Microtome blades Leica 819
Ophthalmic ointment Cisen Pharmaceutical Company G23HDM9M4S5
paraformaldehyde Biosharp BL539A
Peristaltic pumps Harvard Apparatus 70-4507
Phosphate buffered saline Servicebio G4202
Piette 2-200 μL thermofisher 4642080
SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue Beyotime P0015A
Shaving blades BFYING 91560618
Slides Citotest Scientific 188105
Stereotaxic apparatus RWD Life Science 68807
Straight toothed dissecting forceps Jinzhong JD1060
Syringe Holder RWD Life Science 68206
Tissue scissors Jinzhong J21040
Tissue-Tek O.C.T compound Sakura 4583
Tribromoethanol Aibei Biotechnology M2910

Referencias

  1. Liu, D., et al. Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry. Pain. 159 (1), 175 (2018).
  2. Gan, Z., et al. Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex. Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).
  3. Laing, B. T., et al. Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior. Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).
  4. Perens, J., et al. Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system. Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).
  5. Adhikari, A., et al. Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear. Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).
  6. Tao, Y., et al. Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval. Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).
  7. Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).
  8. Ansarifar, S., et al. Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin. Mol Brain. 16 (1), 77 (2023).
  9. Gonzalez, T. J., et al. Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery. Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).
  10. Sun, X. Y., et al. Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice. Cell Rep. 42 (7), 112719 (2023).
  11. Koren, T., et al. Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses. Cell. 184 (25), 6211 (2021).
  12. Poller, W. C., et al. Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress. Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).
  13. Huang, L., et al. A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy. Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).
  14. Hu, Z., et al. A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment. Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).
  15. Du, W., et al. Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus. Cell Rep Methods. 3 (6), 100506 (2023).
  16. Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , (2001).

Play Video

Citar este artículo
Zhou, X., Dai, W., Zhou, J., Zhang, Y., Zhang, X., Chen, S., Sun, X. Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning. J. Vis. Exp. (209), e66262, doi:10.3791/66262 (2024).

View Video