Summary

Voorlopige validatie van stereotaxische injectiecoördinaten via cryosectie

Published: July 19, 2024
doi:

Summary

Het huidige protocol beschrijft een praktische strategie om de verificatiestap van stereotaxische injectiecoördinaten te versnellen voordat virale tracering wordt uitgevoerd met behulp van kleurstoffen en bevroren secties.

Abstract

Stereotaxische injectie van een specifiek hersengebied vormt een fundamentele experimentele techniek in de fundamentele neurowetenschappen. Onderzoekers baseren hun keuze van stereotaxische injectieparameters gewoonlijk op muizenhersenatlassen of gepubliceerd materiaal dat verschillende populaties/leeftijden muizen en verschillende stereotaxische apparatuur gebruikte, waardoor verdere validatie van de stereotaxische coördinatenparameters nodig is. De werkzaamheid van calciumbeeldvorming, chemogenetische en optogenetische manipulaties is afhankelijk van de precieze expressie van reportergenen binnen het interessegebied, wat vaak enkele weken inspanning vereist. Het is dus een tijdrovende taak als de coördinaten van het doelhersengebied niet van tevoren worden geverifieerd. Door een geschikte kleurstof te gebruiken in plaats van een virus en cryosecties uit te voeren, kunnen onderzoekers de injectieplaats onmiddellijk na toediening van de kleurstof observeren. Dit vergemakkelijkt tijdige aanpassingen van de coördinatieparameters in gevallen waarin er discrepanties bestaan tussen de werkelijke injectieplaats en de theoretische positie. Dergelijke aanpassingen verbeteren de nauwkeurigheid van de virale expressie in het doelgebied in volgende experimenten aanzienlijk.

Introduction

Bijna alle moderne neuromodulatietools, waaronder in vivo calciumregistratie, optogenetische en chemogenetische tools, vereisen het gebruik van stereotaxische coördinaten om zich te richten op het interessegebied van de hersenen 1,2,3, dat de basis vormt van neurale manipulatie. Stereotaxische coördinaten voor hersengebieden van muizen worden gedefinieerd in relatie tot bregma en lambda, de benige oriëntatiepunten op de schedel, die het zogenaamde schedel-afgeleide stereotaxische coördinatensysteem vormen. Bregma of lambda kan dienen als het nulpunt van de driedimensionale coördinaten. De drie assen zijn anteroposterieur (AP), mediolateraal (ML) en dorsoventraal (DV) en vertegenwoordigen de y-, x- en z-assen op het digitale display van stereotaxische instrumenten. Voor bekende hersengebieden kunnen de stereotaxische coördinatenparameters van een specifiek gebied worden afgeleid uit muizenhersenatlassen4 (bijv. Paxinos en Franklin’s muizenbrein in stereotaxische coördinaten) en/of de gepubliceerde literatuur 5,6. Verdere validatie is echter nodig vanwege variaties in stereotaxische apparatuur en de leeftijd/populaties van muizen die door verschillende onderzoekers worden gebruikt.

Structuur is de basis van functie. Neurale circuits vormen de basis voor veel hersenfuncties, zoals cognitieve activiteiten, emotie, geheugen, sensorische en motorischefuncties1. Het labelen van de structuur en het manipuleren van de activiteit van neurale circuits zijn van vitaal belang voor het begrijpen van de functie van een specifiek neuraal circuit. In de afgelopen decennia zijn neurale tracers door vele generaties heen geëvolueerd; vroeg onderzoek nam tarwekiemagglutinine (WGA) en phaseolus vulgaris-agglutinine (PHA) aan als anterograde tracers, en fluorogold (FG), choleratoxine subeenheid B (CTB), carbocyanine als retrograde tracers. In tegenstelling tot virale tracers kunnen deze traditionele neurale tracers echter geen exogene genen in de gastheer integreren en hebben ze ook geen selectiviteit van het celtype. Tegenwoordig is de virale strategie een belangrijke propositie geworden tijdens fundamenteel neurowetenschappelijk onderzoek. Voor verschillende onderzoeksdoeleinden kunnen verschillende virale tools worden geselecteerd 7,8. Er zijn niet-transsynaptische virussen, trans-multisynaptische virussen (retrograde en anterograde) en trans-monosynaptische virussen (retrograde en anterograde). Elke categorie bevat verschillende typen met respectievelijke kenmerken.

Het proces van virale toediening en expressie is zeer tijdrovend en arbeidsintensief en duurt vaak weken of zelfs langer. Van de verschillende virale vectoren is adeno-geassocieerd virus geïdentificeerd als een veelbelovend middel voor genafgifte, dat een breed venster biedt van 3 tot 8 weken na injectie voor de experimentele procedure 7,8. Naarmate AAV evolueert, kan analyse 2-3 weken na toediening worden uitgevoerd 9,10. Andere neurale circuittracers, zoals het pseudorabiësvirus (PRV) en het rabiësvirus (RV), vereisen ook een traceringsperiode van ten minste 2-7 dagen 11,12,13,14,15. Een voorafgaande verificatie van de injectieplaats voordat fluorescentiesignalen worden waargenomen, is dus zowel tijd- als kosteneffectief.

Om een eenvoudige en snelle verificatie van stereotaxische injecties mogelijk te maken, wordt in deze studie een kleurstof toegediend vóór virale vectoren, en cryosectie stelt onderzoekers in staat om de injectieplaats te observeren en deze binnen 30 minuten na injectie te volgen.

Protocol

Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van Animal Research Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) en de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. De huidige studie werd goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van het Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Acht weken oude C57BL/6J mannelijke muizen werden gebruikt voor de huidige studie. De dieren werden commercieel verkregen (zie Materiaaltabel) en …

Representative Results

Deze studie identificeerde met succes de injectieplaats binnen 30 minuten met behulp van de gedemonstreerde methode. In eerste instantie werd een SDS-PAGE-oplossing voor het laden van monsters met broomfenolblauw geïnjecteerd in het LDTgV in de C57/BL-muizen. Figuur 1A toont een schematische weergave van de injectie met de kleurstofoplossing. De verdeling van de blauwe kleurstof in de LDTgV wordt geïllustreerd in figuur 1B. Broomfen…

Discussion

Dit artikel heeft een stabiele strategie beschreven om de nauwkeurigheid van stereotaxische herseninjecties 5,6 sneller en eenvoudiger te verifiëren voordat het virus wordt getraceerd, maar het onvervangbare aspect van genexpressie van reporters in het hersengebied is cruciaal voor het labelen van hersengebieden. De blauwe kleurstof die we gebruikten, maakte het mogelijk om de injectieplaats onmiddellijk te visualiseren.

Verschillende…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

National Natural Science Foundation of China (subsidie nr. 82101249 aan XY Sun), Postdoctorale onderzoeksstichting van China (subsidie nr. 2022M722125 aan XY Sun). Shanghai Sailing Program (subsidie nr. 21YF1425100 aan SH Chen). Speciaal project voor klinisch onderzoek van de gemeentelijke gezondheidscommissie van Shanghai (subsidie nr. 202340088 aan J Zhou). Nationale Natuurwetenschappelijke Stichting van China (subsidie nr. 82101262 aan X Zhang, subsidie nr. 82101287 aan SH Chen).

Materials

1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3 Hamilton 65458-01
200 μL pipette tips biosharp BS-200-T
20 mL syringe Kindly group
3%H2O2 solution Lircon Company
6-well plate Shengyou Biotech 20006
Anerdian Likang High-tech 31001002
Anti roll plate Leica 14047742497
BD insulin syringe Becton,Dickinson and Company 328421
Bend toothed dissecting forceps Jinzhong JD1050
Cellsens dimension software Olympus
Cotton swab Fisher Scientific 23-400-122
Dapi-Fluoromount-G Southernbiotech 0100-20
Drill Longxiang
Fine brushes HWAHONG
Fine scissors Jinzhong y00030
Fluorescent microscopy Olympus BX63
freezing microtome Leica CM1950
Hemostatic forceps straight with tooth Jinzhong J31010
Infusion needle 0.7 mm Kindly group
Lidocaine hydrochloride injection Harvest Pharmaceutical Company 71230803
Magnifying glass M&G Chenguang Stationery
Male C57/BL mice The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory
Mice coronal brain slice mold RWD Life Science 68713
Microcentrifuge tube biosharp BS-02-P
Microtome blades Leica 819
Ophthalmic ointment Cisen Pharmaceutical Company G23HDM9M4S5
paraformaldehyde Biosharp BL539A
Peristaltic pumps Harvard Apparatus 70-4507
Phosphate buffered saline Servicebio G4202
Piette 2-200 μL thermofisher 4642080
SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue Beyotime P0015A
Shaving blades BFYING 91560618
Slides Citotest Scientific 188105
Stereotaxic apparatus RWD Life Science 68807
Straight toothed dissecting forceps Jinzhong JD1060
Syringe Holder RWD Life Science 68206
Tissue scissors Jinzhong J21040
Tissue-Tek O.C.T compound Sakura 4583
Tribromoethanol Aibei Biotechnology M2910

Referencias

  1. Liu, D., et al. Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry. Pain. 159 (1), 175 (2018).
  2. Gan, Z., et al. Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex. Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).
  3. Laing, B. T., et al. Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior. Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).
  4. Perens, J., et al. Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system. Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).
  5. Adhikari, A., et al. Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear. Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).
  6. Tao, Y., et al. Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval. Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).
  7. Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. Adeno-associated viral vectors in neuroscience research. Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).
  8. Ansarifar, S., et al. Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin. Mol Brain. 16 (1), 77 (2023).
  9. Gonzalez, T. J., et al. Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery. Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).
  10. Sun, X. Y., et al. Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice. Cell Rep. 42 (7), 112719 (2023).
  11. Koren, T., et al. Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses. Cell. 184 (25), 6211 (2021).
  12. Poller, W. C., et al. Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress. Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).
  13. Huang, L., et al. A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy. Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).
  14. Hu, Z., et al. A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment. Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).
  15. Du, W., et al. Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus. Cell Rep Methods. 3 (6), 100506 (2023).
  16. Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. . The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , (2001).

Play Video

Citar este artículo
Zhou, X., Dai, W., Zhou, J., Zhang, Y., Zhang, X., Chen, S., Sun, X. Preliminary Validation of Stereotaxic Injection Coordinates via Cryosectioning. J. Vis. Exp. (209), e66262, doi:10.3791/66262 (2024).

View Video