Utilisation du clivage sous cibles et du test de marquage (CUT & Tag) dans la recherche sur le myoblaste chez la souris

Le test CUT&Tag a été inventé pour compenser certains défauts manifestes des ChIPs¹. Les deux principaux inconvénients des ChIPs sont 1) le biais introduit lors de la fragmentation de la chromatine et 2) l’incompétence à travailler avec un faible nombre de cellules. Les dosages X-ChIP reposent sur la sonication ou la digestion MNase pour obtenir des fragments de chromatine, tandis que la N-ChIP utilise principalement la digestion MNase pour obtenir des nucléosomes. La sonication montre un biais vers les emplacements de la chromatine détendus tels que les régions promotrinales², et apparemment, la digestion de la MNase fonctionne également plus efficacement sur les fibres de chromatine détendues. De plus, certains ont rapporté que la digestion de la MNase présente également un biais dépendant de la séquence d’ADN³. Par conséquent, à l’étape de préparation des tests ChIP, il est impossible d’obtenir des fragments de chromatine de toutes sortes d’emplacements génomiques de manière parfaitement aléatoire. De plus, les tests ChIP génèrent normalement des signaux de fond plus élevés que CUT&Tag et nécessitent plus de 10 fois plus de lectures que CUT&Tag pour accentuer là où les pics sont^{de 1,4,5}. C’est pourquoi les expériences ChIP doivent commencer avec beaucoup plus de cellules que CUT&Tag. Ce n’est pas un problème lors de l’étude des lignées cellulaires car elles peuvent être passées de manière répétitive pour obtenir un nombre de cellules très élevé. Cependant, le test ChIP n’est certainement pas un outil épigénétique puissant pour étudier des populations de cellules primaires rares ou précieuses, bien que les cellules primaires aient évidemment des implications plus pratiques et médicales.

Bien que la procédure longue et compliquée de la ChIP décourage certains chercheurs d’apprendre ou d’utiliser cette technique, les gens sont plus à l’aise avec des tests plus faciles tels que l’immunocytochimie (ICC) ou l’immunofluorescence (IF). Un test CUT&Tag ressemble essentiellement au processus des expériences ICC et IF, mais n’a lieu que dans un tube à essai. CUT&Tag n’a pas besoin de chromatine fragmentée pour commencer, mais le génome doit être intact pour la liaison de l’anticorps¹. Le premier jour d’une expérience ChIP, les chercheurs passent normalement jusqu’à 4 heures à préparer les chromatines fragmentées des noyaux par sonication ou digestion MNase avant que les courts morceaux de chromatine puissent être mélangés avec des billes d’anticorps ^4,5. À l’opposé, la charge de travail du premier jour d’une procédure CUT&Tag consiste simplement à immobiliser les cellules dans des billes de Concanavalin-A, puis à ajouter l’anticorps primaire sur les billes cellulaires. Cela ne nécessite que ~40 min¹.

Il convient de mentionner que le clivage sous les cibles et la libération à l’aide de nucléases (CUT & RUN) est une alternative importante à CUT&Tag. CUT&RUN a été créé sur la base d’un mécanisme de fonctionnement similaire à celui de CUT&Tag. Dans CUT&Tag, les anticorps guident la transposase pA/G-Tn5 vers tous les endroits où l’enzyme va chacun découper un morceau de chromatine et le marquer pendant ce temps avec des adaptateurs créant une bibliothèque, tandis que dans CUT&RUN, le rôle de pA/G-Tn5 est joué par la pA/G-MNase qui n’effectue que la partie coupante du travail⁶. Par conséquent, par rapport à CUT&Tag, CUT&RUN nécessite une étape supplémentaire qui consiste à coller les adaptateurs de création de bibliothèque sur les morceaux d’ADN fragmentés pA/G-MNase ^7,8. En raison des grandes similitudes entre CUT&Tag et CUT&RUN, les chercheurs familiers avec CUT&TAG s’adapteront facilement à la réalisation compétente de CUT&RUN. Cependant, il convient de noter qu’il existe quelques différences mineures entre CUT&Tag et CUT&RUN. Les protocoles CUT&RUN utilisent normalement la concentration physique de sel (~150 mM) dans les étapes de lavage, tandis que dans CUT&Tag, le tampon de lavage 300-Dig est riche en sel. Par conséquent, CUT&Tag est efficace pour contrôler le bruit de fond lors du profilage des marques/variantes d’histones ou des facteurs de transcription, car ces protéines se lient directement et fortement à l’ADN¹. CUT&Tag peut rencontrer des problèmes lors du profilage des facteurs associés à la chromatine qui ne se lient pas directement à l’ADN et montrent une faible affinité avec la chromatine. Les étapes élevées de lavage au sel dans CUT&Tag peuvent éliminer les facteurs associés à la chromatine et ne provoquer aucun signal dans la sortie finale. Bien qu’il existe des cas réussis où CUT&Tag peut être utilisé pour profiler certaines protéines non histones/non-facteurs de transcription⁹, nous recommandons toujours CUT&RUN plutôt que CUT&Tag pour profiler les protéines associées à la chromatine faiblement liées.

Une fois que les mammifères ont atteint l’âge adulte, leurs tissus musculaires squelettiques contiennent encore des cellules souches musculaires. Lors d’une lésion musculaire, ces cellules souches peuvent être activées et subir une expansion et une différenciation du nombre de cellules pour régénérer les fibres musculaires endommagées¹⁰. Ces cellules souches sont connues sous le nom de cellules souches/satellites musculaires (MuSC). Une fois que les MuSC sont isolés chez les animaux ou une fois activés par une blessure musculaire, ils commencent à proliférer et deviennent des myoblastes.

Pour obtenir des MuSC à partir de la digestion des muscles squelettiques de souris, les marqueurs de surface MuSC tels que Vcam1 (Cd106), Cd34 et l’intégrine α7 (Itga7) sont souvent utilisés individuellement ou en combinaison pour enrichir les MuSC lors du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)¹¹. Il a été démontré que Cd31^–/Cd45^–/^Sca1-/Vcam1⁺ est probablement la meilleure combinaison de marqueurs pour obtenir des MuSCs¹² purs à >95%. Le FACS peut isoler les MuSC purs juste après la digestion des muscles frais. Cependant, si la conception expérimentale ne nécessite pas de MuSC purs dès leur isolement, le pré-placage est plus rentable que le FACS pour obtenir des myoblastes purs à >90% (descendance MuSC).

Les MuSC fraîchement isolés chez la souris ne prolifèrent pas efficacement dans les milieux F10 de Ham complétés par du sérum fœtal bovin (FBS). Pour mieux augmenter le nombre de cellules de MuSC et obtenir suffisamment de myoblastes, le sérum de croissance bovine (BGS) doit être utilisé à la place du FBS. Cependant, si le BGS n’est pas disponible, le milieu complet F10 de Ham (contenant environ 20 % de FBS) peut être mélangé avec un volume égal de milieu conditionnel à cellules T pour favoriser considérablement l’expansion des myoblastes¹³. Par conséquent, ce protocole décrira également la préparation de milieux MuSC conditionnés par des cellules T.

Plus important encore, ce protocole fournit un exemple complet de réalisation de tests H3K4me1 CUT&Tag sur des myoblastes de souris isolés des muscles des membres postérieurs de souris. Veuillez noter que ce protocole s’applique également à d’autres types de cellules et aux marques d’histones et aux variantes d’histones, et que les lecteurs n’ont qu’à optimiser le nombre de cellules ou les quantités d’anticorps pour leurs cas en fonction de l’enrichissement des marques ou variantes d’histones spécifiques qu’ils étudient.

Pour être utilisée dans CUT&Tag ou CUT&RUN, la Tn5 ou la MNase doit être fusionnée avec la protéine A ou la protéine G pour former pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase ou pG-MNase. Apparemment, les protéines A et G peuvent être fusionnées sur ces enzymes en même temps pour générer pA/G-Tn5 ou pA/G-MNase. Les protéines A et G présentent des affinités différentielles pour les IgG de différentes espèces. Par conséquent, la fusion des protéines A et G sur l’enzyme peut surmonter ce problème et rendre l’enzyme compatible avec les anticorps de plusieurs espèces.