在小鼠成肌细胞研究中使用靶标和标记下的切割（CUT&Tag）测定
Summary
刚进入表观遗传学领域的研究人员会发现 CUT&Tag 是 ChIP 检测的明显更容易的替代品。CUT&Tag极大地促进了稀有细胞群和原代细胞群的表观遗传学研究，从极少数细胞中生成了高质量的数据。该协议描述了在从小鼠后肢肌肉分离的小鼠成肌细胞上进行H3K4me1 CUT和Tag测定。
Abstract
该协议论文旨在为新研究人员提供使用靶标和标记下的切割（CUT&Tag）来分析染色质结合因子，组蛋白标记和组蛋白变体的基因组位置的全部详细信息。CUT&Tag协议对小鼠成肌细胞和新鲜分离的肌肉干细胞（MuSCs）效果非常好。只要细胞可以被刀豆球-A珠固定，它们就可以很容易地应用于许多其他细胞类型。与CUT&Tag相比，染色质免疫沉淀（ChIP）测定是耗时的实验。ChIP 检测需要先对染色质进行预处理，然后才能将染色质材料用于免疫沉淀。在交联 ChIP （X-ChIP） 中，染色质的预处理涉及交联和超声处理以片段化染色质。在天然 ChIP （N-ChIP） 的情况下，片段化的染色质通常通过微球菌核酸酶 （MNase） 消化来实现。超声处理和 MNase 酶解都会给 ChIP 实验带来一些偏差。与ChIPs相比，CUT&Tag检测可以在更少的步骤内完成，并且需要的细胞要少得多，但可以提供有关不同基因组位置的转录因子或组蛋白标记的更公正的信息。CUT&Tag可以处理低至5,000个单元格。由于其比 ChIP 具有更高的灵敏度和更低的背景信号，因此研究人员有望在测序后仅从数百万个reads中获得可靠的峰数据。
Introduction
CUT&Tag 检测的发明是为了弥补 ChIPs1 的一些明显缺陷。ChIP 的两个主要缺点是 1） 染色质片段化时引入的偏差和 2） 无法处理低细胞数。X-ChIP 检测依靠超声处理或 MNase 消化来获得染色质片段，而 N-ChIP 主要使用 MNase 消化来获得核小体。超声处理显示偏向于松弛的染色质位置，例如启动子区域2，显然，MNase 消化对松弛的染色质纤维也更有效。此外，一些报道称，MNase消化也显示出DNA序列依赖性偏倚3。因此，在 ChIP 检测的起始制备步骤中，不可能以完全随机的方式从各种基因组位置获得染色质片段。此外，与 CUT&Tag 相比，ChIP 检测通常产生更高的背景信号，并且需要比 CUT&Tag 多 10 倍以上的读取才能在峰为1、4、5 的地方突出。这就解释了为什么 ChIP 实验必须从比 CUT&Tag 多得多的细胞开始。在研究细胞系时，这不是问题，因为它们可以重复传代以获得非常高的细胞数量。然而，ChIP 检测绝对不是研究稀有或珍贵原代细胞群的强大表观遗传学工具，尽管原代细胞显然具有更多的实用和医学意义。
虽然漫长而复杂的 ChIP 程序使一些研究人员不愿学习或使用这种技术，但人们更习惯于使用免疫细胞化学 （ICC） 或免疫荧光 （IF） 等更简单的检测方法。CUT&Tag检测基本上类似于ICC和IF实验的过程，但仅在试管中进行。CUT&Tag一开始就不需要片段化的染色质，相反，基因组必须完整才能结合抗体1。在 ChIP 实验的第一天，研究人员通常花费长达 4 小时的时间通过超声处理或 MNase 消化从细胞核中制备碎片化的染色质，然后才能将短染色质片段与抗体珠混合 4,5。与此形成鲜明对比的是，CUT&Tag程序的第一天工作量是将细胞固定到刀豆球蛋白A珠上，然后将一抗添加到细胞珠上。这只需要 ~40 分钟1。
值得一提的是，使用核酸酶在靶点下的切割和释放（CUT&RUN）是CUT&Tag的重要替代品。CUT&RUN是基于与CUT&Tag类似的工作机制建立的。在 CUT&Tag 中，抗体将 pA/G-Tn5 转座酶引导到酶各自切出一段染色质的所有位置，同时用造库接头标记它，而在 CUT&RUN 中，pA/G-Tn5 的作用由 pA/G-MNase 扮演，它只执行工作的切割部分6。因此，与CUT&Tag相比，CUT&RUN需要一个额外的步骤，即将造文接头粘附到pA/G-MNase片段化的DNA片段上7,8。由于 CUT&Tag 和 CUT&RUN 之间的高度相似性，熟悉 CUT&Tag 的研究人员很容易适应熟练执行 CUT&RUN。但是，应该注意的是，CUT&Tag 和 CUT&RUN 之间存在一些细微的差异。CUT&RUN协议通常在洗涤步骤中使用盐的物理浓度（~150 mM），而在CUT&Tag中，300-Dig洗涤缓冲液的盐含量很高。因此，在分析组蛋白标记/变异或转录因子时，CUT&Tag善于控制背景，因为这些蛋白质直接且强烈地结合DNA1。CUT&Tag在分析染色质相关因子时可能会遇到问题，这些因子不直接结合DNA并且对染色质的亲和力较弱。CUT&Tag中的高盐洗涤步骤可能会剥离染色质相关因子，并在最终输出中导致没有信号。尽管有成功的案例表明，CUT&Tag可用于分析一些非组蛋白/非转录因子蛋白9，但我们仍然建议使用CUT&RUN而不是CUT&Tag来分析弱结合的染色质相关蛋白。
哺乳动物成年后，它们的骨骼肌组织仍然含有肌肉干细胞。在肌肉损伤期间，这些干细胞可以被激活并经历细胞数量的扩展和分化，以再生受损的肌肉纤维10。这些干细胞被称为肌肉干细胞/卫星细胞（MuSCs）。MuSCs从动物中分离出来或一旦被肌肉损伤激活，它们就会开始增殖并成为成肌细胞。
为了从小鼠骨骼肌消化物中获得 MuSC，在荧光激活细胞分选 （FACS） 11 期间，通常单独或组合使用 MuSC 表面标记物，如 Vcam1 （Cd106）、Cd34 和 α7-整合素 （Itga7），以富集 MuSCs11。研究表明，Cd31–/Cd45–/Sca1–/Vcam1+ 可能是获得>95%纯度MuSCs12的最佳标记组合。FACS可以在新鲜肌肉消化后立即分离出纯MuSCs。然而，如果实验设计不需要在分离时直接使用纯 MuSC，则预铺板比 FACS 更具成本效益，以获得 >90% 纯成肌细胞（MuSC 后代）。
从小鼠中新鲜分离的 MuSC 在补充有胎牛血清 （FBS） 的 Ham’s F10 培养基中不能有效增殖。为了更好地增加 MuSC 的细胞数量并获得足够的成肌细胞，应使用牛生长血清 （BGS） 代替 FBS。然而，如果 BGS 不可用，可以将 Ham 的 F10 全培养基（含有约 20% FBS）与等体积的 T 细胞条件培养基混合，以显着促进成肌细胞扩增13。因此，该协议还将描述T细胞培养基条件的MuSC培养基的制备。
最重要的是，该协议提供了在从小鼠后肢肌肉中分离的小鼠成肌细胞上执行H3K4me1 CUT和Tag测定的完整示例。请注意，该协议也适用于其他细胞类型以及组蛋白标记和组蛋白变体，读者只需根据他们研究的特定组蛋白标记或变体的富集来优化其病例的细胞数量或抗体量。
为了在CUT&Tag或CUT&RUN中使用，Tn5或MNase需要与蛋白A或蛋白G融合，形成pA-Tn5、pG-Tn5、pA-MNase或pG-MNase。显然，蛋白 A 和蛋白 G 可以同时融合到这些酶上，产生 pA/G-Tn5 或 pA/G-MNase。蛋白 A 和蛋白 G 对不同物种的 IgG 的亲和力不同。因此，将蛋白 A 和蛋白 G 完全融合到酶上可以克服这个问题，并使酶与来自多个物种的抗体兼容。
Protocol
Representative Results
Discussion
某种CUT&Tag反应中所需的特定细胞数量完全依赖于要测试的组蛋白标记/变体或染色质结合蛋白的富集。通常，对于非常富集的组蛋白标记，如H3K4me1，H3K4me3和H3K27ac等，25,000-50,000个成肌细胞对于一个CUT&Tag反应来说是相当足够的。然而，一些罕见的染色质结合蛋白可能需要多达 250,000 个细胞。CUT&Tag检测中使用的细胞数量至关重要，如果处理不当，通常会导致检测失败。在CUT&Tag反应中使用过多的细胞?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了中国科学院战略性优先研究计划（XDA16020400至菲律宾）的支持;国家自然科学基金（32170804至菲律宾）。
Materials
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004177 | |
| Concanavalin-A | Sigma-Aldrich | C5275 | |
| Concanavalin-A beads | Bangs Laboratories | BP531 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 300410 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| H3K4me1 antibody | abcam | ab8895 | |
| Ham's F10 media | Thermo Fisher Scientific | 11550043 | |
| Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina | Vazyme | TD903 | This kit has been tested by us to function well |
| Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes | Qualityard | QYM06 | |
| Magnetic rack for 8-PCR tube stripes | Anosun Magnetic | CLJ16/21-021 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | NEB | M0541L | For library-making PCR reaction |
| pA-Tn5 | Vazyme | S603-01 | Needs to be mounted with adaptors before use |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| Proteinase K | Beyotime | ST535-100mg | |
| RPMI-1640 media | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG) | Antibodies-online | ABIN101961 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | |
| TruePrep Index Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD202 | This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers |
| VAHTS DNA Clean Beads | Vazyme | N411 | Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size |
Referencias
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