Um ensaio químico de acetil-clique para medir a acetilação de histona acetiltransferase 1
Summary
Ensaios químicos rápidos e precisos para triagem de inibidores específicos são uma ferramenta importante no arsenal de desenvolvimento de fármacos. Aqui, apresentamos um ensaio químico escalável de acetil-clique para medir a inibição da atividade de acetilação do HAT1.
Abstract
HAT1, também conhecido como Histone acetiltransferase 1, desempenha um papel crucial na síntese de cromatina estabilizando e acetilando H4 nascente antes da montagem do nucleossomo. É necessário para o crescimento do tumor em vários sistemas, tornando-se um alvo potencial para o tratamento do câncer. Para facilitar a identificação de compostos que podem inibir a atividade enzimática do HAT1, desenvolvemos um ensaio de acetil-clique para triagem rápida. Neste ensaio simples, empregamos HAT1/Rbap46 recombinante, que é purificado a partir de células humanas ativadas. O método utiliza o análogo 4-pentynoyl-CoA (4P) do acetil-CoA em uma abordagem de química de cliques. Isso envolve a transferência enzimática de uma alça de alcino através de uma reação de acilação dependente de HAT1 para um peptídeo N-terminal H4 biotinilado. O peptídeo capturado é então imobilizado em placas neutravidina, seguido de funcionalização click-química com biotina-azida. Posteriormente, o recrutamento de estreptavidina-peroxidase é empregado para oxidar o vermelho de amplex, resultando em uma produção fluorescente quantitativa. Através da introdução de inibidores químicos durante a reação de acilação, podemos quantificar a inibição enzimática com base na redução do sinal de fluorescência. É importante ressaltar que essa reação é escalável, permitindo a triagem de alto rendimento de potenciais inibidores da atividade enzimática do HAT1.
Introduction
Dentre as numerosas acetiltransferases eucarióticas, a HAT1 foi a histona acetiltransferase inicial a ser isolada 1,2,3. Investigações subsequentes estabeleceram firmemente seu papel fundamental na replicação da cromatina, particularmente na síntese de novos nucleossomos durante a faseS 4. Nossos esforços de pesquisa levaram ao reconhecimento de que o HAT1 é altamente estimulado pelo tratamento com fator de crescimento epidérmico (EGF) em células mamárias5. Além disso, veio à tona que o TAH1 é necessário para a rápida proliferação celular e formação tumoral de vivo6,7,8,9. Os dados indicam que o HAT1 é crítico na coordenação de processos anabólicos e epigenéticos para a divisão celular, impulsionando o crescimento tumoral.
HAT1 di-acetila a cauda amino-terminal da histona H4 nas lisinas 5 e 12 em complexo com a proteína chaperona Rbap46, que se liga à histona e apresenta o amino-terminal ao HAT1. Tetrâmeros de histona ou disomos10, juntamente com HAT1/Rbap46 e outras chaperonas de histonas11, são então importados para o núcleo. As histonas são então liberadas para serem depositadas na bifurcação de replicação ou em outros locais para suportar a ativação ou repressão gênica. A função da marca de di-acetilação HAT1 na histona H4 não é totalmente compreendida. É provável que seja rapidamente removido dentro de um período de 15-30 min pela ação de histonas desacetilases 12,13,14,15 após a inserção de H4 na cromatina. Assim, a marca de di-acetilação HAT1 não é propagada na cromatina e pode não desempenhar um verdadeiro papel epigenético, embora um papel no recrutamento de enzimas modificadoras da cromatina para a cromatina nascente tenha sido postulado12. Além disso, HAT1 não acetila diretamente a cromatina; sua atividade é restrita a histonas solúveis.
O desenvolvimento de inibidores da acetiltransferase de histonas de pequenas moléculas tem sido dificultado por ensaios inespecíficos e de baixo rendimento, resultando muitas vezes na geração de compostos biologicamente reativos16,17. O ensaio padrão-ouro para medir as atividades da acetiltransferase requer o uso de 3H-acetil-coA, que limita o rendimento e requer radiação. No entanto, recentemente, inibidores específicos e altamente potentes da acetiltransferase de pequenas moléculas visando CBP/p30018 e KAT6A/B19,20 foram descritos e confirmados através do uso de 3H-acetil-CoA. Avançando, ensaios aprimorados para alcançar melhor rendimento e evitar riscos de laboratório estão sendo desenvolvidos.
Avanços recentes no monitoramento da acetilação21 têm utilizado a química de cliques para permitir o monitoramento de reações enzimáticas. Há uma variedade de precursores habilitados por clique que são acessíveis por rotas sintéticas simples ou disponíveis para compra que podem ser incorporados em reações enzimáticas. Essas reações são tipicamente realizadas em sistemas recombinantes, embora ensaios baseados em células também sejam viáveis22. A vantagem dos cofatores e substratos habilitados por clique é que a triagem pode medir diretamente a atividade enzimática sem a necessidade de sistemas de leitura acoplados que são frequentemente perturbados por compostos de triagem e exigem etapas adicionais de manuseio. Isso permite tratamentos com inibidores apenas durante a etapa enzimática, enquanto todas as etapas de funcionalização e detecção a jusante são realizadas após lavagem extensiva para remover compostos, limitando assim o potencial de interferência do ensaio. Essas vantagens tornam o projeto de ensaios habilitados por clique preferível aos ensaios acoplados que geralmente dependem da detecção de coenzima A livre.
Uma consideração importante é a aceitação de cofatores habilitados por clique no sítio ativo da enzima. Os cofatores existentes habilitados para clique podem não ser totalmente compatíveis com o site ativo otimizado para o cofator nativo. Informações estruturais e modelagem podem ser usadas para projetar substituições de aminoácidos para ampliar o sítio ativo e incorporar substratos alterados23. Isso pode permitir a triagem com melhor cinética enzimática e níveis mais baixos de substrato e enzima. A desvantagem dessa abordagem é que bolsas catalíticas alteradas podem não identificar inibidores que interagem fortemente com a enzima nativa. Em última análise, uma combinação de abordagens é necessária para identificar e validar potenciais inibidores enzimáticos.
Aqui, descrevemos um método desenvolvido para purificar e dosar a atividade da enzima HAT1 usando o cofator clique 4-pentynoyl-CoA24. Este ensaio (Figura 1) usa a sequência enzimática nativa em complexo com sua proteína parceira necessária Rbap46, que demonstrou aumentar a atividade enzimática. A purificação da enzima a partir de células humanas permite a ativação enzimática no celulo, o que pode preservar modificações pós-traducionais estimulantes importantes para a plena atividade enzimática. O projeto e a otimização de ensaios enzimáticos recombinantes para telas químicas de alto rendimento têm sido usados com sucesso para identificar e caracterizar inibidores de pequenas moléculas de HAT1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Na última década, a química de cliques tornou-se proeminente20, permitindo o projeto preciso de estruturas químicas interagentes. Dentro deste contexto, várias conexões covalentes bioortogonais21 têm emergido como opções promissoras para a formação de complexos em seu ambiente natural. A química de cliques emprega pares de grupos funcionais que exibem reações rápidas e seletivas, comumente conhecidas como “reações de clique”. Estas reações ocorrem eficien…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a George Zheng por fornecer H4K12CoA. Agradecemos aos membros do Gruber Lab pelas discussões e comentários úteis. Agradecemos o apoio do NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) e da V Foundation (V2022-022).
Materials
| 4P CoA | Cayman Chemical | 10547 | Click chemistry co-factor |
| Amplex Red | Fisher Sci | A12222 | Fluorescence substrate |
| Biotin-PEG-Azide | Alfa Aesar | J64996MC | Click chemistry |
| Copper Sulfate | Sigma-aldrich | 7758-98-7 | Click chemistry |
| DMSO | Fisher Scientific | 67-68-5 | diluent |
| DTT | Acros Organics | 03-12-3483 | reducting agent |
| Forskolin | VWR | 102987-310 | Protein expression |
| Freestyle 293 Expression Medium | Thermo Fisher | 12338018 | Media |
| Freestyle 293-F cells | Thermo Fisher | R790-07 | Protein expression |
| H4-peptide/1-23-GGK-biotin | Anaspec | AS65097 | peptide substrate |
| HEPES | Sigma-aldrich | 7365-45-9 | EB buffer |
| Hydrogen peroxide 30% solution | Sigma-aldrich | Z00183-99-0 | initiator |
| M2 FLAG antibody slurry | Millipore-Sigma | A2220 | Protein purification |
| Macrosep 10K Filter (Pall Lab) | VWR | 89131-980 | Protein purification |
| Neutravidin Plate | Thermo Sci | 15127 | BSA-pre-blocked |
| NP40 (IGEPAL) | MP Biomedical | 198596 | 20x buffer |
| pHEK-293 plasmid | Takara Bio | 3390 | Protein expression |
| Phosphate Buffered Saline 10x | Alfa Aesar | Z00082-33-6 | wash buffer |
| Pra peptide | Genscript | Custom synthesis | biotinylated |
| Sodium Ascorbate | Sigma-aldrich | 134-03-2 | Click chemistry |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich | 7647-14-5 | EB buffer |
| Sodium phosphate | VWR International | 7558-80-7 | buffer |
| Streptavidin | EMD Millipore | 189730 | competitor |
| Streptavidin-HRP | Cell Signaling | 3999S | enzyme |
| THPTA ligand | Fisher Sci | 1010-500 | Click chemistry |
| Tris base | Sigma-aldrich | 77-86-1 | 20x buffer |
| Triton-X 100 | VWR International | 9002-93-1 | EB buffer |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | 9005-64-5 | Wash buffer |
| Urea | Sigma-Aldrich | 57-13-6 | quencher |
Referencias
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