당사는 Harwell의 Research Complex에 있는 결정화 시설을 사용하여 단백질의 결정화를 위한 프로토콜을 제시하고 Diamond의 Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) 빔라인에서 플레이트 내의 결정으로부터 후속 in situ X선 결정학 데이터 수집을 제시합니다. 시료 요구 사항, 결정화 프로토콜 및 데이터 수집 지침에 대해 설명합니다.
Harwell의 결정화 시설을 사용한 로봇 단백질 결정화 프로토콜과 Diamond Light Source beamline VMXi의 결정화 플레이트에서 현장 실온 데이터 수집에 대해 설명합니다. 이 접근 방식을 사용하면 여러 결정에서 고품질 실온 결정 구조를 간단한 방식으로 결정할 수 있으며 결정화 시험 결과에 대한 매우 빠른 피드백을 제공할 뿐만 아니라 연속 결정학을 가능하게 합니다. 단백질 구조, 리간드 결합 및 역학을 이해하는 데 있어 실온 구조의 가치는 구조 생물학 커뮤니티에서 점점 더 인정받고 있습니다. 이 파이프라인은 여러 가지 사용 가능한 액세스 모드를 통해 전 세계 사용자가 액세스할 수 있습니다. 설정된 결정화 실험은 기계 학습 도구를 사용하여 자동으로 식별된 결정으로 원격으로 이미지화하고 볼 수 있습니다. 데이터는 플레이트에서 사용자가 선택한 결정에서 최대 60° 회전 데이터 세트가 있는 대기열 기반 시스템에서 측정됩니다. 특정 웰 또는 샘플 그룹 내의 모든 결정의 데이터는 xia2.multiplex를 사용하여 자동으로 병합되며, 출력은 웹 브라우저 인터페이스를 통해 직접 액세스할 수 있습니다.
X선 결정학은 단백질 구조와 기능을 이해하기 위한 핵심 도구로, 단백질 또는 복합체의 고분해능 구조와 기질 또는 약물 후보 물질을 제공합니다. 그러나, 많은 경우에, 바람직한 특성(회절이 심하고, 침지가 가능한 결정 형태이며, 쌍둥이와 같은 결정 병리학이 없는)을 갖는 결정을 얻는 것은 상당한 병목 현상으로 남아 있다1. 단백질 결정을 생성하기 위한 적절한 화학적 조건은 일반적으로 예측할 수 없기 때문에 수천 가지의 잠재적 화학 혼합물을 탐색하는 결정화 스크리닝이 표준이며, 종종 자동화/로봇 공학의 도움을 받아 모니터링을 위한 스크린 및 크리스탈 호텔을 모니터링하고, 종종 원격으로 결정화 드롭 이미지를 모니터링합니다.
결정이 나타나면 일반적으로 나일론 또는 Kapton 루프를 사용하여 결정화 환경에서 수확한 다음 액체 질소에 담그기 전에 동결 방지제가 포함된 액적(검색은 추가 변수임)으로 옮겨야 합니다. 결정화와 X선 데이터 수집 사이의 이러한 추가 단계에는 밀봉된 환경이 파괴될 때 결정화 방울의 탈수, 취급 시 결정에 가해지는 기계적 응력, 동결 보호제에서 결정 격자에 대한 손상(일반적으로 모자이크 확산 증가)이 포함될 수 있습니다2. 또한 결정 채취는 시간과 노동 집약적이며, 특히 채취 과정에서 입자에 피부가 형성될 때 시료 간에 불균일성이 발생할 수 있습니다. VMXi 빔라인은 플레이트에 부착된 크리스탈에서 사용 가능한 데이터에 액세스할 수 있도록 하며, 그렇지 않으면 데이터 수집을 위해 폐기됩니다.
대부분의 X선 결정 구조는 위의 접근 방식을 사용하여 100K에서 측정되므로 간단한 결정 수송 및 취급이 가능하고 X선 빔의 결정 수명이 수십 배로 늘어납니다. 그러나 비극저온 조건, 즉 단백질 기능 2,3,4와 관련된 생리학적 조건에 훨씬 더 가까운 구조를 결정하는 데 관심이 증가하고 있습니다. 이를 통해 단백질의 동적 구조를 훨씬 더 잘 이해할 수 있고, 아미노산 형태 또는 루프가 기능적으로 관련이 없는 상태로 얼어붙는 것을 방지할 수 있으며5, 리간드 결합을 세포와 유기체 내 단백질의 자연 환경에 훨씬 더 가까운 조건에서 탐색할 수 있습니다6.
영국 Diamond Light Source 싱크로트론의 Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) 빔라인에서 구현된 대안적인 접근법은 결정이 성장한 환경(즉, 결정화 플레이트 내) 내에서 주변 조건 하에서 방해 없이 결정에서 직접 회절 데이터를 측정하는 것입니다 7,8. 이를 통해 결정화 스크린 및 최적화에서 매우 빠른 피드백을 통해 사용자가 요구 사항에 맞는 최적의 결정 형태를 찾을 수 있도록 안내할 수 있습니다. 또한 고품질 실온 구조물을 자동화된 방식으로 생산할 수 있다9.
이 프로토콜은 사용자가 결정화 준비가 된 고순도 단백질 샘플을 가지고 있다고 가정합니다. 단백질 결정을 생산한 다음 데이터 수집을 위해 빔라인 VMXi를 사용하기 위해 Harwell의 결정화 시설에 액세스하는 사용자 경험을 설명합니다(그림 1).
Harwell의 결정화 시설
Harwell(CF)의 결정화 시설은 Diamond Light Source에 인접한 Harwell(RCaH)의 Research Complex에 있습니다. 이 시설은 결정화 스크리닝, 결정 최적화, 결정 이미징 및 특성화를 위해 로봇 공학을 사용하여 고분자 결정화를 위한 고처리량 자동화 실험실을 사용자에게 제공합니다. 고도로 자동화된 VMXi 빔라인과의 긴밀한 통합을 통해 실온 구조 결정 속도가 크게 빨라졌으며 비극저온 조건에서 새로운 단백질 구조, 단백질-리간드 및 DNA-리간드 복합체의 특성 분석과 자동화된 단편 스크리닝(그림 1)이 가능합니다.
CF 파이프라인은 용해성 및 막 단백질의 결정화를 위한 나 노리터 결정화 로봇9, 상업용 결정화 스크린 및 복잡한 맞춤형 최적화 스크린을 준비하기 위한 액체 처리 로봇, 결정화 플레이트의 이미징을 위한 4개의 이미징 장비(4°C에서 1개, 20°C에서 3개)를 포함하는 계측 제품군입니다( 재료 표 참조).). 이미저 1개는 지질 입방상(LCP) 유리판을 이미징할 수 있고 이미저 1개에는 다중 형광 광학 장치(둘 다 20°C)가 장착되어 있습니다.
이 시설은 현재 MPL(Membrane Protein Laboratory; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), XChem 단편 스크리닝 설비( 10), MX 빔라인, XFEL-허브, 및 로잘린드 프랭클린 연구소(RFI)도 포함된다. 이 잘 정립되고 최적화된 파이프라인은 광범위한 구조 생물학 프로젝트에서 결정화 실험을 수행할 수 있게 해주었습니다. 이 백서에서는 VMXi에서 데이터 수집을 위한 크리스털의 파이프라인에 대해 설명하지만, 크리스털을 수확하여 극저온 냉각하거나 XChem 파이프라인으로 보낼 수도 있습니다.
사용자 액세스는 Diamond MX 제안 시스템(https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html)을 통해 할당되며 산업 사용자는 Diamond Industry Liaison 그룹을 통해 지원됩니다. 모든 사용자는 손으로 운반할 수 있는 샘플 또는 플레이트를 가지고 현장에 올 수 있습니다. 우리의 경험에 따르면 방울이 분배된 위치에서 멀어지거나 결정화 저장소에 의해 방울이 손상될 수 있으므로 택배로 플레이트를 보내는 것은 권장하지 않습니다. 또는 협의에 따라 사용자가 단백질 샘플을 CF로 보낼 수 있으며, CF에서 직원이 대신 결정화 실험을 설정할 수 있습니다. 실험은 사용자가 Rock Maker Web(CF의 경우) 또는 ISPyB(VMXi의 경우)에 로그온하여 원격으로 모니터링할 수 있습니다. CF에 대한 접근은 Diamond에서 수집된 X선 회절 결과를 기반으로 반복적인 방식으로 수행될 수 있습니다.
다이아몬드 광원의 빔라인 VMXi
Beamline VMXi(이하 “빔라인”이라고 함)는 적절한 결정화 플레이트 내의 결정에서 데이터를 측정하는 데 중점을 둔 실온의 고도로 자동화된 X선 결정학 전용으로 최근에 개발된 고유한 기기입니다. 빔라인은 ~2 ×10 13 photons/s(16 KeV에서)7의 높은 플럭스와 함께 마이크로 초점(10 x 10 μm), 분홍색 빔(<5 × 10-2ΔE/E의 대역 통과)을 제공합니다. 이 고플럭스 빔은 고속 검출기와 결합되어 매우 높은 시료 처리량과 10μm 이상의 시료에서 데이터 수집을 가능하게 합니다.
결정화 플레이트는 샘플 저장 시스템에 저장되고 ISPyB11 인터페이스 SynchWeb12를 사용하여 플레이트를 등록하는 동안 사용자가 제공한 일정에 따라 이미징되어 빔라인으로 들어갑니다. 일반적으로 사용자는 이미징을 위해 피보나치 시점 시퀀스를 선택하는 것이 좋습니다(0, 12, 24, 36, 60… 시스템에 들어가는 플레이트로부터 7,320시간). 플레이트가 이미지화되면 사용자에게 이메일로 알림이 전송됩니다. 가시광선과 UV 광선 이미징 모두 사용자가 필요에 따라 사용할 수 있습니다. 샘플 저장 시스템에서 촬영한 이미지는 기계 학습 알고리즘에 의해 분석됩니다. 이렇게 하면 크리스탈과 유사한 개체의 관심 영역을 자동으로 찾아 정의하고 사용자가 데이터 수집을 위해 큐에 추가할 수 있도록 관심 영역을 등록합니다. 또한 사용자는 가시광선 이미지를 수동으로 클릭하여 관심 지점을 등록하거나 래스터 스캔으로 분석할 영역을 클릭하고 드래그할 수 있습니다. 이러한 포인트는 사용자가 자동으로 찾은 포인트와 함께 대기열에 추가할 수 있습니다.
모든 샘플에 데이터 수집을 위한 적절한 파라미터가 있으면 플레이트가 대기열에 들어갑니다. 플레이트가 대기열의 맨 위에 도달하면 자동으로 빔라인에 분배됩니다. 결정화 플레이트는 로봇 팔에 의해 크리스탈 호텔에서 빔라인으로 자동으로 로드되며, 이미지 매칭 후 사용자 정의 지침에 따라 선택한 각 크리스탈에서 최대 60° 회전의 결정학적 데이터 세트를 측정합니다. 플레이트 내의 모든 방울은 빔라인에서 이러한 실험에 사용할 수 있습니다. 데이터는 여러 결정에서 병합되어 자동화된 방식으로 동형, 최적으로 병합된 데이터 세트를 생성합니다 7,9. 대기 중인 모든 데이터 세트가 수집되면 다른 Diamond MX 빔라인과 마찬가지로 ISPyB11에서 데이터 세트를 보기 위해 따라야 할 링크가 포함된 이메일이 사용자에게 전송됩니다. 또한 사용자는 빔라인 웹 페이지(https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html)로 이동합니다.
CF에 단백질 샘플이 도착하는 것부터 추가 응용을 위해 사용자가 최종 데이터를 다운로드하는 것까지의 전체 절차를 설명했습니다. 중요한 단계는 상용 희소 매트릭스 스크린 또는 확립된 조건에 기반한 최적화 스크린을 사용하여 고품질 단백질 샘플과 적절한 결정 스크린을 생산하는 것입니다. 이 공정은 CF에서 수행되거나 사용자가 가정 실험실에서 결정화 절차를 수행하고 빔라인에 적합한 결정화 플레이트를 가져올 수 있습니다. 적절한 데이터 수집 매개변수의 식별은 특정 샘플, 특히 방사선 손상이 우려되는 경우에 중요할 수 있습니다. 대부분의 경우, 자동화된 데이터 처리만으로도 과학적 질문에 답할 수 있지만, 예를 들어 공간 그룹이 모호하거나 방사선 손상 영향을 최소화하기 위해 수집된 데이터의 초기 부분만 사용되는 경우와 같이 빔라인 도구를 사용하여 재처리할 수 있는 기능을 보유합니다.
초기 결정화 시험에서 적합한 결정이 생성되지 않으면 단백질 농도, 순도 또는 결정화 스크린의 변화를 탐색할 수 있으며 결정 파종의 사용도 가능합니다. 결정이 빔라인에서 유용한 분해능으로 회절되지 않는 경우, 감쇠되지 않은 빔과 함께 그리드 스캔을 사용하여 결정의 고유한 회절 한계 및 단위 셀을 평가하여 최적화 노력을 안내할 수 있습니다. 플레이트 내에서 데이터를 수집하기에는 너무 작은 결정(예: <10μm)은 대신 연속 결정학 또는 나노 초점 실험(예: 다이아몬드 빔라인 VMXm)에 적합할 수 있습니다. VMXi 데이터를 사용하여 구조를 해결하는 것은 일반적으로 분자 교체를 통해 간단하며, 특히 효과적인 검색 모델을 제공하기 위해 Alphafold16 이 등장한 이후 더욱 그렇습니다. 이것이 성공적이지 않은 경우, 플레이트에서 결정을 수확하고 극저온 냉각하여 기존의 단일 파장 이상 회절, 다중 파장 이상 회절 또는 장파장 위상 실험을 가능하게 할 수 있습니다.
이 방법의 장점은 결정이 성장한 환경에서 결정을 방해할 필요 없이 결정화 플레이트에서 직접 신속한 고품질 데이터 세트와 피드백을 얻을 수 있다는 것입니다. 구조 생물학에서 소위 ‘실온 르네상스’는 생리학적 관련성과 단백질 역학을 더 많이 탐구할 수 있도록 비극저온 조건에서 얻은 구조를 중요시합니다2. 일반적으로 최적화된 극저온 냉각 결정보다 약간 낮은 분해능이 달성되지만 적절한 극저온 조건이 설정되고 결정이 결정화 드롭의 기계적 취급 및 개방에 강건한 경우에만 달성됩니다3. 이 파이프라인이 매우 적합한 향후 응용 분야는 약물 발견에서 실온에서 단백질-리간드 복합체 또는 단편 캠페인의 대규모 스크리닝입니다. 리간드 또는 단편은 실온 데이터 수집 전에 피펫 또는 음향 방울 배출에 의해 공결정화되거나 추가될 수 있습니다. 또 다른 응용은 매우 효율적인 방식으로 수백 또는 수천 개의 결정체로부터 데이터를 신속하게 측정한 다음, DIALS17 멀티플렉스(14 ) 소프트웨어를 사용하여 상이한 생물학적 실체를 나타낼 수 있는 동형 클러스터를 추출하거나, 상이한 방식으로 처리되거나 상이한 리간드 또는 신호에 노출된 결정의 집단 간에 통계적으로 유의한 차이를 확립하는 것이다.
The authors have nothing to disclose.
VMXi 빔라인의 설계, 시공 및 운영에 기여한 많은 Diamond Light Source 과학자와 지원 팀원에게 감사드립니다. 나중에 결정화 및 데이터 수집 파이프라인 개발에 아이디어를 제공한 빔라인 사용자에게 감사드립니다. Harwell의 결정화 시설은 Diamond Light Source Ltd, Rosalind Franklin Institute 및 Medical Research Council의 지원을 받습니다.
Formulator | Formulatrix | on request | Liquid handling robot |
Formulatrix imager | Formulatrix | on request | Crystallisation plate imager |
Greiner CrystalQuick X | Greiner | Z617644 | Crystallisation plate |
Gryphon | Art Robbins Instruments | 620-1000-10 | Crystalisation robot |
MiTeGen Insitu-1 | Mitegen | InSitu-01CL-40 | Crystallisation plate |
Mosquito LCP | (SPT Labtech) | on request | Crystallisation robot |
Rock Imager & Maker | Formualtrix | on request |
Software for Imager [1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/ |
Scorpion | Art Robbins Instruments | 640-1000-10 |
Liquid handling robot https://www.artrobbins.com/scorpion |