壮药药用线灸疗法及其在原发性痛经冷凝证大鼠模型中的应用

本研究中的动物实验由广西中医药大学动物实验伦理委员会（伦理许可证号 DW20230411-45）审核通过。动物操作规程严格遵循《关于治疗实验动物的指导意见》（国科发财字〔2006〕398号）和国际疼痛研究学会（IASP）的动物保护使用标准的内容。 注意：本研究使用 SPF 级雌性大鼠，6 周龄，体重为 200 g ± 20 g。根据阴道涂片选择发情期大鼠，采用随机数法分为 4 组。分为载体组、冷凝型痛经模型组（模型组）、冷凝型痛经模型组+西医组（药物组）、冷凝型痛经模型组+壮药线艾灸组（艾灸组），每组12只大鼠。载体组：动物用生理盐水 （0.9% 氯化钠） 处理。模型组： 冷凝综合征痛经模型建模过程中，未进行干预，仅进行与艾灸组相同的约束和固定。医药组： 从致敏第 6 天起，每天灌胃给予溶于 0.9% 氯化钠溶液的布洛芬。每只大鼠给予 0.06 g/kg。艾灸组： 从致敏第 6 天开始，每日用壮药线进行艾灸治疗。该组每天上午 8 点接受 1 次治疗，连续 7 天。所有动物均饲养在广西国际壮医医院实验动物科学中心（洁净级）。大鼠在塑料笼中喂养，4 只大鼠在一个笼子里。他们正常进食和饮水，保持昼夜节律交替，室内应该保持干燥。室温控制在 23 ± 1 °C，湿度为 60% ± 5%。 1. 痛经伴冷凝综合征大鼠模型的建立 冷冻：在第 1-12 天，用腹膜内注射 0.3% 戊巴比妥 （30 mg/kg） 麻醉大鼠，然后将它们每天在冰上 20 分钟，连续 12 天。 致敏： 第 1-12 天，皮下注射大鼠苯甲酸雌二醇，以增强子宫对引起疼痛物质的敏感性。在第 1 天和第 12 天，注射 0.8 毫克/动物;第 2天至第 11 天，注射 0.4 毫克/动物。 疼痛诱导：第 12天， 注射苯甲酸雌二醇后 1 h，大鼠腹腔注射 2 U 催产素，引起疼痛。注：该模型是使用全身冷冻法结合苯甲酸雌二醇和催产素注射液10 创建的。 按照步骤 1.4.1-1.4.4 中的说明处理每个动物组。对于载体组中的大鼠，不要执行步骤 1.1-1.3。单独用生理盐水（0.9% 氯化钠）治疗。 对于模型组中的大鼠，执行步骤 1.1-1.3。以类似于艾灸组的方式约束组中的动物，但没有任何药物/治疗干预。 对于药物组中的大鼠，执行步骤 1.1-1.3。从致敏的第 6 天（步骤 1.2）开始，将布洛芬溶解在 0.9% 氯化钠溶液中，每天通过管饲法给药（0.06 g/kg）。 对于艾灸组中的大鼠，执行步骤 1.1-1.3。从致敏第 6 天（步骤 1.2）开始，每天上午 8 点用壮药线（第 4 节）进行艾灸治疗，连续 7 天。 2. 设置壮药线程的艾灸模拟器 长按 按钮 1 进入设置状态。短按 按钮 2 （加号） 或 按钮 3 （减号）， 将出现一个 132 代码。将按钮输入设置为每按一次输出 0.5 厘米。 重复步骤 2.1 直到出现代码 130，设备可以在点火后 6 秒内自动点火。 重复步骤 2.1，直到出现代码 131，仪器自动进行艾灸 2 次。 旋转速度控制按钮将频率设置为 2 次/秒。注意： 按钮编号详见 补充图 1。 3. 壮药线的制备 药液的制备根据不同疾病的治疗选择药液配置。本实验中，使用乳香 10 克、檀香 10 克、木本香 10 克、桃仁 10 克、红花 10 克、当归尾 10 克、方峰 10 克、红牡丹 10 克、须木 10 克、干姜 10 克、姜黄 10 克。将这些成分浸泡在 1000 mL 的 75% 酒精中，并在 10 天后过滤以形成药液。 浸泡药线：将苎麻线在上述药液中浸泡至少10天（图2），取出药线进行艾灸，将药线密封在瓶中备用。 使用时每次取出一根长度约为 21 厘米的药用线（图 3）。 4. 壮药线灸的干预方法 穴位选择注意：通过腹膜内注射 0.3% 戊巴比妥 （30 mg/kg） 麻醉大鼠。使用小型动物剃须机清洁大鼠腹部的毛发。 根据线灸治疗痛经的经验，选择神阙、观元、中际、子宫穴等穴位11、12、13 。用记号笔在大鼠的下腹部标记上述穴位。注意：穴位参见 图 4 。申阙（CV8，连接剑突和耻骨联合上缘的线上 2/3 和下 1/3 的交点）;关元（CV4，申阙穴下 25 mm）;中基（CV3，冠源穴下 8 mm）;左子宫穴位（左，EX-CA1，中济穴左侧开口 25 mm）;右侧子宫穴位（右，EX-CA1，中济穴右侧开口 25 毫米）。 修复老鼠使用高弹性橡皮筋（亚克力板尺寸 10 厘米× 15 厘米× 5 厘米）将大鼠固定在透明的亚克力板上，露出腹部。 将固定的大鼠放在壮药线灸模拟器的手术台上，调整定位环以粘附在大鼠的腹部，并左右调整大鼠的位置，使一个标记的穴位位于定位环的中心（图 5）。 放置药物线取出一根浸湿的药线，将其插入药线控制装置中。 旋转支撑框架垂直轴和水平轴上的螺丝旋钮。上下调整药物管路控制装置的外壳，使外壳底部与定位环底部的距离为 2 cm（图 6），并相应地调整点火支撑轴和定位杆轴。 单击进线按钮，将药丝露出距离外壳 0.5 厘米（将电线末端设置为每次按压退出 0.5 厘米）（图 7）。 穴位艾灸按下点火按钮，点火装置会自动点火。默认计时为 6 秒。之后，将进行两次自动艾灸，频率设置为 2 次/秒（图 8）注意：之前已经反复测试过，在温度为 23 ± 1 °C、湿度为 60% ± 5% 的无风环境中，6 秒后可能会形成珠火。 穴位艾灸后，移动透明亚克力框架以调整其位置，使下一个需要艾灸的穴位位于定位圈的中心。重复步骤 4.3.3 和 4.4.1。 5. 扭转划线操作 给大鼠注射催产素 （2 U） 并将它们放入空笼中。 观察每只大鼠在 20 分钟内的扭转反应。注意：除载体组外，每组选择 6 只大鼠。如果发生扭曲反应，则在大鼠中成功建立原发性痛经模型14。生理盐水组注射等剂量生理盐水。本研究使用了 Schmauss15提出的行为评分：对于正常的探索行为，0 分;躯干向一侧倾斜，腹部因收缩而向内凹陷，1 分;后肢伸展，后爪背屈，躯干伸展伴骨盆旋转，2 分;腹肌收缩、后肢伸展、3 分（图 9）潜伏期、扭转次数和扭转反应的扭转评分均在 20 分钟内记录。大鼠扭动的潜伏期是从注射催产素（引起疼痛）到大鼠首次出现扭动反应的时间（分钟）。扭转分数 = [0 级（次数）× 0 分 + 1 级（频率）× 1 分 + 2 级（频率）× 2 分 + 3 级（频率）× 3 分]。 6. 红外热成像 通过腹膜内注射 0.3% 戊巴比妥 30 mg/kg 麻醉每组其余 6 只大鼠，暴露子宫投影区域。 手术后，将大鼠置于红外热像仪镜头的视野中，并使用红外热像仪记录子宫投影区域的温度。 测量每个穴位 3 次，取平均值作为该穴位的温度。 使用热成像软件导出红外热图像（图 10）。注：建模第 12天 （ 即干预第7 天）， 每组其余 6 只大鼠进行红外热成像观察。患有冷凝综合征的原发性痛经大鼠子宫表面投影温度会降低。观察大鼠子宫的表面投影温度可以确定冷凝综合征的严重程度。温度越低，冷凝综合征越严重。