Summary

Identificação de Peptídeos de Pequenas Vesículas Extracelulares de Macrófagos Derivados da Medula Óssea

Published: June 30, 2023
doi:

Summary

Este protocolo descreve um procedimento para isolar pequenas vesículas extracelulares de macrófagos por ultracentrifugação diferencial e extrair o peptidoma para identificação por espectrometria de massas.

Abstract

Pequenas vesículas extracelulares (EVs) são tipicamente secretadas pela exocitose de corpos multivesiculares (MVBs). Estas nanovesículas com um diâmetro de <200 nm estão presentes em vários fluidos corporais. Esses sEVs regulam vários processos biológicos, como transcrição e tradução de genes, proliferação e sobrevivência celular, imunidade e inflamação por meio de suas cargas, como proteínas, DNA, RNA e metabólitos. Atualmente, várias técnicas têm sido desenvolvidas para o isolamento de sEVs. Dentre eles, o método baseado em ultracentrifugação é considerado o padrão-ouro e é amplamente utilizado para o isolamento de sEVs. Os peptídeos são naturalmente biomacromoléculas com menos de 50 aminoácidos de comprimento. Esses peptídeos participam de uma variedade de processos biológicos com atividade biológica, como hormônios, neurotransmissores e fatores de crescimento celular. O peptidoma destina-se a analisar sistematicamente peptídeos endógenos em amostras biológicas específicas por cromatografia líquida-espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS). Aqui, introduzimos um protocolo para isolar sEVs por ultracentrifugação diferencial e extraímos peptidoma para identificação por LC-MS/MS. Este método identificou centenas de peptídeos derivados de sEVs de macrófagos derivados da medula óssea.

Introduction

Pequenas vesículas extracelulares (EVs) com diâmetro inferior a 200 nm estão presentes em quase todos os tipos de fluidos corporais e são secretadas por todos os tipos de células, incluindo urina, suor, lágrimas, líquido cefalorraquidiano e líquido amniótico1. Inicialmente, os sEVs foram considerados como recipientes para disposição de resíduos celulares, o que levou a pesquisas mínimas na década subsequente2. Recentemente, evidências crescentes indicam que os sEVs contêm proteínas específicas, lipídios, ácidos nucléicos e outros metabólitos. Essas moléculas são transportadas para as células-alvo3, contribuindo para a comunicação intercelular, por meio da qual participam de vários processos biológicos, como reparo tecidual, angiogênese, imunidade4 einflamação5,6, desenvolvimento tumoral e metástase7,8,9, etc.

Para facilitar o estudo de sEVs, é imperativo isolar sEVs de amostras complexas. Diferentes métodos de isolamento de sEVs foram desenvolvidos com base nas propriedades físicas e químicas de sEVs, tais como sua densidade, tamanho de partícula e proteínas marcadores de superfície. Essas técnicas incluem métodos baseados em ultracentrifugação, métodos baseados em tamanho de partículas, métodos baseados em captura de imunoafinidade, métodos baseados em precipitação de sEVs e métodos baseados em microfluídica10,11,12. Dentre essas técnicas, o método baseado em ultracentrifugação é amplamente reconhecido como o padrão-ouro para o isolamento de EVs e é a técnica mais comumente utilizada13.

Uma quantidade crescente de evidências sugere a presença de uma infinidade de peptídeos biologicamente ativos não descobertos nos peptidomas de vários organismos. Esses peptídeos contribuem significativamente para inúmeros processos fisiológicos, regulando o crescimento, o desenvolvimento, a resposta ao estresse 14,15 e a transdução de sinal16. O objetivo do peptidoma dos sEVs é descobrir os peptídeos transportados por esses sEVs e fornecer pistas sobre suas funções biológicas. Aqui, apresentamos um protocolo de isolamento de sEVs através de ultracentrifugação diferencial, seguido de extração de peptídeos desses sEVs para análise posterior de seu peptidoma.

Protocol

1. Isolamento de pequenas vesículas extracelulares NOTA: Efectuar toda a centrifugação nos passos 1.1-1.11 a 4 °C. Preparação de soro fetal bovino (FBS) livre de sEVs: Centrifugar FBS durante a noite a 110.000 × g a 4 °C através de uma ultracentrífuga (ver Tabela de Materiais) para remover sEVs endógenos. Recolher o sobrenadante, filtrar, esterilizar-lhe com uma membrana de ultrafiltração de 0,2 μm e armazená-lo a -20 °C.</li…

Representative Results

Para os sEVs isolados por ultracentrifugação diferencial (Figura 1), avaliamos sua morfologia, distribuição granulométrica e marcadores proteicos de acordo com a Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares (ISEV)17. Primeiramente, a morfologia das EVs foi observada por MET, mostrando uma estrutura típica em forma de taça (Figura 2A). NTA mostrou que os sEVs isolados estavam concentrados principa…

Discussion

Ao investigar a função de sEVs, é imperativo obter sEVs de alta pureza a partir de amostras biológicas complexas para evitar quaisquer contaminações potenciais. Uma variedade de métodos para o isolamento de sEVs tem sido desenvolvida13, e entre esses métodos, métodos baseados em ultracentrifugação diferencial têm mostrado pureza relativamente alta de sEVs. Neste estudo, 200 mL de sobrenadante celular foram coletados por 6 h, e cerca de 200-300 μg de sEVs foram obtidos por ultracentrif…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi financiado por bolsas da Fundação de Ciências Naturais da China (3157270). Agradecemos ao Dr. Feng Shao (Instituto Nacional de Ciências Biológicas, China) por fornecer o iBMDM.

Materials

BCA Protein Assay Kit Beyotime Technology P0012
CD9 Beyotime Technology AF1192
Centrifugal filter tube Millipore UFC5010BK
Centrifuge bottles polypropylene Beckman Coulter 357003 High-speed centrifuge
Chemiluminescent substrate Thermo Fisher Scientific 34580
Dithiothreitol Solarbio D8220 100 g
DMEM culture medium Cell World N?A
GRP94 Cell Signaling Technology 20292
High-speed centrifuge Beckman Coulter Avanti JXN-26 Centrifuge rotor (JA-25.50)
Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) National Institute of Biological Sciences, China Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China)
Iodoacetamide Sigma l1149 5 g
Microfuge tube polypropylene Beckman Coulter 357448 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge 
nano-high-performance LC system Thermo Fisher Scientific EASY-nLC 1000
Nanoparticle tracking analysis  Malvern Panalytical NanoSight LM10 NanoSight NTA3.4
Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer Thermo Fisher Scientific N/A
Phosphate-buffered saline Solarbio P1020
Polyallomer centrifuge tubes Beckman Coulter 326823 Ultracentrifuge
Protease inhibitor Bimake B14002
SpeedVac vacuum concentrator Eppendorf Concentrator plus
Tabletop ultracentrifuge Beckman Coulter Optima MAX-XP Ultracentrifuge rotor (TLA 55)
Transmission electron microscope HITACHI H-7650B
TSG101 Sigma AF8258
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima XPN-100 Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti)
Ultrasonic cell disruptor Scientz SCIENTZ-IID
Western Blot imager Bio-Rad ChemiDocXRs Image lab 4.0 (beta 7)
β-actin Sigma A3853

Referencias

  1. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
  2. Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
  3. Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
  4. Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
  5. Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
  6. Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
  7. Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
  8. Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
  9. Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
  10. Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
  11. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  12. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
  13. Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
  14. Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
  15. Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
  16. Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
  17. Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
  18. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  19. Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
  20. Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. Peptidome: Chaos or inevitability. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128 (2021).
  21. Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
  22. Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).

Play Video

Citar este artículo
Cheng, J., Zhu, J., Liu, Y., Yang, C., Zhang, Y., Liu, Y., Jin, C., Wang, J. Identification of Peptides of Small Extracellular Vesicles from Bone Marrow-Derived Macrophages. J. Vis. Exp. (196), e65521, doi:10.3791/65521 (2023).

View Video