골수 유래 대식세포에서 작은 세포외 소포의 펩타이드 식별
Summary
이 프로토콜은 차등 초원심분리에 의해 대식세포로부터 작은 세포외 소포를 분리하고 질량분석법에 의한 식별을 위해 펩티돔을 추출하는 절차를 설명합니다.
Abstract
작은 세포외 소포(sEV)는 일반적으로 다소포체(MVB)의 엑소사이토시스에 의해 분비됩니다. 직경 <200nm의 나노소포는 다양한 체액에 존재합니다. 이 sEV는 단백질, DNA, RNA 및 대사 산물과 같은 화물을 통해 유전자 전사 및 번역, 세포 증식 및 생존, 면역 및 염증과 같은 다양한 생물학적 과정을 조절합니다. 현재 sEV 분리를 위한 다양한 기술이 개발되고 있습니다. 그 중 초원심분리 기반 방법은 황금 표준으로 간주되며 sEV 분리에 널리 사용됩니다. 펩타이드는 길이가 50개 미만의 아미노산을 가진 천연 생체거대분자입니다. 이러한 펩타이드는 호르몬, 신경 전달 물질 및 세포 성장 인자와 같은 생물학적 활성을 가진 다양한 생물학적 과정에 참여합니다. 펩티돔은 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법(LC-MS/MS)을 통해 특정 생물학적 샘플의 내인성 펩타이드를 체계적으로 분석하기 위한 것입니다. 여기에서는 차등 초원심분리에 의해 sEV를 분리하는 프로토콜을 도입하고 LC-MS/MS에 의한 식별을 위해 펩티돔을 추출했습니다. 이 방법은 골수 유래 대식세포에서 수백 개의 sEV 유래 펩타이드를 식별했습니다.
Introduction
직경이 200nm 미만인 작은 세포외 소포체(sEV)는 거의 모든 유형의 체액에 존재하며 소변, 땀, 눈물, 뇌척수액 및 양수를 포함한 모든 종류의 세포에서 분비됩니다1. 처음에 sEV는 세포 폐기물 처리를 위한 용기로 간주되어 이후 10년 동안 최소한의 연구로 이어졌습니다2. 최근 sEV에 특정 단백질, 지질, 핵산 및 기타 대사 산물이 포함되어 있다는 증거가 증가하고 있습니다. 이 분자들은 표적 세포3로 운반되어 세포간 통신에 기여하며, 이를 통해 조직 복구, 혈관신생, 면역4 및 염증5,6, 종양 발달 및 전이 7,8,9 등과 같은 다양한 생물학적 과정에 참여한다.
sEV 연구를 용이하게 하려면 복잡한 샘플에서 sEV를 분리하는 것이 필수적입니다. 밀도, 입자 크기 및 표면 마커 단백질과 같은 sEV의 물리적, 화학적 특성을 기반으로 다양한 sEV 분리 방법이 개발되었습니다. 이러한 기술에는 초원심분리 기반 방법, 입자 크기 기반 방법, 면역친화성 포획 기반 방법, sEV 침전 기반 방법 및 미세유체 기반 방법이 포함됩니다(10,11,12). 이러한 기술 중 초원심분리 기반 방법은 sEV 분리의 황금 표준으로 널리 인식되고 있으며 가장 일반적으로 사용되는 기술입니다13.
점점 더 많은 증거가 다양한 유기체의 펩티돔에 발견되지 않은 수많은 생물학적 활성 펩타이드가 존재함을 시사합니다. 이 펩타이드는 성장, 발달, 스트레스 반응 14,15 및 신호 전달16을 조절함으로써 수많은 생리적 과정에 크게 기여합니다. sEV의 펩티돔의 목적은 이러한 sEV에 의해 운반되는 펩타이드를 밝히고 생물학적 기능에 대한 단서를 제공하는 것입니다. 여기에서 우리는 차등 초원심분리를 통해 sEV를 분리한 다음 펩티돔의 추가 분석을 위해 이러한 sEV에서 펩타이드를 추출하는 프로토콜을 제시합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
sEV의 기능을 조사할 때 잠재적인 오염을 피하기 위해 복잡한 생물학적 샘플에서 고순도 sEV를 얻는 것이 필수적입니다. sEVs 분리를 위한 다양한 방법들이 개발되었으며13, 이 방법들 중 시차 초원심분리 기반 방법들은 상대적으로 높은 순도의 sEV를 보여주었다. 이 연구에서는 200mL의 세포 상청액을 6시간 동안 수집하고, 약 200-300μg의 sEV를 차등 초원심분리에 의해 얻었습니다. 그러…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 자연 과학 재단 (3157270)의 보조금으로 지원되었습니다. iBMDM을 제공해 주신 Feng Shao 박사(중국 국립 생물 과학 연구소)에게 감사드립니다.
Materials
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime Technology | P0012 | |
| CD9 | Beyotime Technology | AF1192 | |
| Centrifugal filter tube | Millipore | UFC5010BK | |
| Centrifuge bottles polypropylene | Beckman Coulter | 357003 | High-speed centrifuge |
| Chemiluminescent substrate | Thermo Fisher Scientific | 34580 | |
| Dithiothreitol | Solarbio | D8220 | 100 g |
| DMEM culture medium | Cell World | N?A | |
| GRP94 | Cell Signaling Technology | 20292 | |
| High-speed centrifuge | Beckman Coulter | Avanti JXN-26 | Centrifuge rotor (JA-25.50) |
| Immortalized bone marrow-derived macrophages (iBMDM) | National Institute of Biological Sciences, China | Provided by Dr. Feng Shao (National Institute of Biological Sciences, China) | |
| Iodoacetamide | Sigma | l1149 | 5 g |
| Microfuge tube polypropylene | Beckman Coulter | 357448 | 1.5 mL, Tabletop ultracentrifuge |
| nano-high-performance LC system | Thermo Fisher Scientific | EASY-nLC 1000 | |
| Nanoparticle tracking analysis | Malvern Panalytical | NanoSight LM10 | NanoSight NTA3.4 |
| Orbitrap Q Exactive HF-X mass spectrometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| Phosphate-buffered saline | Solarbio | P1020 | |
| Polyallomer centrifuge tubes | Beckman Coulter | 326823 | Ultracentrifuge |
| Protease inhibitor | Bimake | B14002 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Eppendorf | Concentrator plus | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima MAX-XP | Ultracentrifuge rotor (TLA 55) |
| Transmission electron microscope | HITACHI | H-7650B | |
| TSG101 | Sigma | AF8258 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima XPN-100 | Ultracentrifuge rotor (SW32 Ti) |
| Ultrasonic cell disruptor | Scientz | SCIENTZ-IID | |
| Western Blot imager | Bio-Rad | ChemiDocXRs | Image lab 4.0 (beta 7) |
| β-actin | Sigma | A3853 |
Referencias
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
- Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication. Nature Cell Biology. 21 (1), 9-17 (2019).
- Chen, G., et al. Exosomal PD-L1 contributes to immunosuppression and is associated with anti-PD-1 response. Nature. 560 (7718), 382-386 (2018).
- Ti, D., et al. LPS-preconditioned mesenchymal stromal cells modify macrophage polarization for resolution of chronic inflammation via exosome-shuttled let-7b. Journal of Translational Medicine. 13, 308 (2015).
- Sun, H., et al. Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduction and Targeted Therapy. 6 (1), 187 (2021).
- Xun, J., et al. Cancer-derived exosomal miR-138-5p modulates polarization of tumor-associated macrophages through inhibition of KDM6B. Theranostics. 11 (14), 6847-6859 (2021).
- Tai, Y. L., Chen, K. C., Hsieh, J. T., Shen, T. L. Exosomes in cancer development and clinical applications. Cancer Science. 109 (8), 2364-2374 (2018).
- Mashouri, L., et al. Exosomes: composition, biogenesis, and mechanisms in cancer metastasis and drug resistance. Molecular Cancer. 18 (1), 75 (2019).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. International Journal of Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: toward clinical application. The Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1152-1162 (2016).
- Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. Progress in exosome isolation techniques. Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).
- Palanski, B. A., et al. An efficient urine peptidomics workflow identifies chemically defined dietary gluten peptides from patients with celiac disease. Nature Communications. 13, 888 (2022).
- Kalaora, S., et al. Identification of bacteria-derived HLA-bound peptides in melanoma. Nature. 592 (7852), 138-143 (2021).
- Hamley, I. W. Small bioactive peptides for biomaterials design and therapeutics. Chemical Reviews. 117 (24), 14015-14041 (2017).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
- Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kim, Y. G., Lone, A. M., Saghatelian, A. Analysis of the proteolysis of bioactive peptides using a peptidomics approach. Nature Protocols. 8 (9), 1730-1742 (2013).
- Lyapina, I., Ivanov, V., Fesenko, I. Peptidome: Chaos or inevitability. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 13128 (2021).
- Keller, M. D., et al. Decoy exosomes provide protection against bacterial toxins. Nature. 579 (7798), 260-264 (2020).
- Koeppen, K., et al. Let-7b-5p in vesicles secreted by human airway cells reduces biofilm formation and increases antibiotic sensitivity of P. aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (28), e2105370118 (2021).
