Summary

Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae (맥주효모균의 단일 복제 유전자 자리, 염색질 정제)

Published: November 17, 2023
doi:

Summary

이 프로토콜은 신진 효모인 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae)에서 네이티브 염색질 맥락에서 관심 있는 단일 복제 유전자 자리를 정제하기 위해 부위 특이적 재조합을 기반으로 하는 유전자좌 특이적 염색질 분리 방법을 제시합니다.

Abstract

진핵 염색질의 기본 조직 단위는 뉴클레오솜 코어 입자 (NCP)이며, 이는 히스톤 옥타머 주위에 ~ 1.7 배 감싼 DNA로 구성됩니다. 크로마틴은 NCP와 전사 인자, 염색질 리모델링 및 변형 효소를 포함한 수많은 다른 단백질 복합체의 실체로 정의됩니다. 이러한 단백질-DNA 상호 작용이 세포주기의 여러 단계에서 특정 게놈 위치 수준에서 어떻게 조정되는지는 아직 불분명합니다. 이는 주로 현재의 기술적 한계로 인해 이러한 동적 상호 작용의 정확한 측정값을 얻기가 어렵기 때문입니다. 여기서는 부위 특이적 재조합과 효율적인 단일 단계 친화성 정제 프로토콜을 결합하여 네이티브 염색질 상태에서 단일 복제 관심 유전자 자리를 분리하는 개선된 방법을 설명합니다. 이 방법은 게놈 크로마틴에 대한 표적 자리의 강력한 농축을 허용하므로 이 기술은 질량 분석법과 같은 편향되지 않고 체계적인 방식으로 단백질 상호 작용을 식별하고 정량화하기 위한 효과적인 전략이 됩니다. 이러한 조성 분석에 더하여, 이 방법에 의해 정제된 천연 염색질은 뉴클레오솜 위치 지정 및 히스톤 변형에 관한 생체 내 상황을 반영할 가능성이 높으며, 따라서 효모의 거의 모든 게놈 유전자좌에서 유래한 염색질의 추가 구조 및 생화학적 분석에 적합합니다.

Introduction

진핵생물 게놈을 염색질로 역동적으로 조직하면 DNA가 핵의 한계 내에 맞도록 압축되는 동시에 유전자 발현을 위한 충분한 역학과 조절 인자에 대한 접근성을 보장합니다. 부분적으로, 이 다재다능함은 히스톤 옥타머1 주위에 ~1.7배 감싼 DNA의 147 bp를 가진 핵심 입자를 포함하는 염색질의 기본 단위인 뉴클레오솜에 의해 매개됩니다. 뉴클레오솜은 N- 및 C-말단 히스톤 꼬리에 수많은 히스톤 변이체와 번역 후 변형(PTM)이 있는 구성과 관련하여 매우 역동적인 구조입니다. 또한 진핵 염색질은 전사 인자, DNA 및 RNA 처리 기계, 건축 단백질, 염색질 리모델링 및 변형에 관여하는 효소, 염색질과 관련된 RNA 분자와 같은 다양한 다른 필수 구성 요소와 상호 작용합니다. 전사, 복제 및 복구와 관련된 이러한 중요한 기계는 모두 이러한 과정의 천연 기질 역할을 하는 크로마틴에 대한 접근이 필요합니다. 결과적으로, 이러한 DNA 거래의 기초가 되는 분자 메커니즘을 이해하려면 이러한 기계가 수렴하고 생물학적 반응을 촉진하는 특정 게놈 영역에서 염색질 구조의 집합적 변화를 정확하게 정의해야 합니다.

유전학 및 단백질-단백질 상호 작용 연구를 통해 수많은 염색질 인자를 식별했음에도 불구하고 특정 게놈 부위에서 염색질 상호 작용에 대한 직접적이고 편향되지 않은 포괄적인 분석을 수행하는 것은 중요한 장애물로 남아 있습니다 2,3. 초기에는 게놈의 매우 풍부한 영역(즉, 반복적 유전자좌) 또는 다중 복제 플라스미드만 관련 단백질 4,5,6,7의 질량 분석 식별을 위해 충분한 양과 순도로 분리할 수 있었습니다. 크로마틴화된 DNA에 대한 포획 프로브의 직접 하이브리드화, CRISPR-dCas9 시스템을 사용한 근접 비오틴화 또는 염기서열 특이적 어댑터 단백질을 관심 유전자좌에 결합하는 것을 기반으로 하는 일련의 새로운 접근 방식은 효모 및 포유류 게놈 8,9,10에서 단일 복제 유전자좌의 단백질체를 풀기 시작했습니다. 그러나 이러한 모든 방법은 단백질-DNA 상호 작용을 안정화하기 위해 포름 알데히드 교차 결합과 후속 정제를 위해 염색질을 용해시키기 위해 초음파 처리가 필요합니다. 두 조작 모두 정제된 크로마틴의 후속 구조적 및 기능적 연구 가능성을 배제합니다.

이러한 한계를 극복하기 위해 우리는 이전에 효모11,12에서 표적 염색체 도메인을 추출하기 위해 부위 특이적 재조합을 사용하는 방법론을 고안했습니다. 본질적으로, 관심의 게놈 영역은 Zygosaccharomyces rouxi의 부위 특이적 R-재조합효소에 대한 인식 부위(RS)로 둘러싸여 있으며, 동시에 동일한 영역 내에서 원핵생물 전사 억제제 LexA 단백질(LexA)에 대한 3개의 DNA 결합 부위 그룹을 통합합니다. 효모 세포에는 R-재조합효소의 동시 발현을 위한 발현 카세트와 탠덤 친화성 정제(TAP) 태그에 융합된 LexA 단백질이 포함되어 있습니다. R-재조합효소의 유도 후, 효소는 원형 염색질 도메인의 형태로 염색체에서 표적 영역을 효율적으로 절제합니다. 이 도메인은 LexA DNA 결합 부위와 친화성 지지체에 결합하는 LexA-TAP 어댑터 단백질을 통해 정제할 수 있습니다. 이 방법은 효모 염색체 III13의 선택된 복제 기원을 포함하는 뚜렷한 염색질 도메인을 분리하는 데 최근에 사용되었습니다.

생체 외 접근법의 주요 장점 중 하나는 분리된 물질의 기능적 분석이 가능하다는 것입니다. 예를 들어, 이 방법으로 정제된 복제 기원 도메인은 in vitro 복제 분석을 통해 native in vivo 조립 염색질 템플릿으로부터 시험관에서 기원 발화의 효율성을 평가할 수 있습니다. 궁극적으로, 분리된 물질의 생화학적 및 기능적 특성화는 천연 염색질 주형과 함께 정제된 단백질을 사용하여 핵 공정의 재구성을 허용할 수 있습니다. 요약하면, 이 방법론은 특정 염색체 거래를 겪는 특정 게놈 영역의 집합적 구성 및 구조적 염색질 변화를 추적할 수 있기 때문에 염색질 연구에서 흥미로운 길을 열어줍니다.

Protocol

이 프로토콜에 사용된 모든 재료 및 도구와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. 표 1 에서 사용된 솔루션, 버퍼 및 매체 목록을 참조하십시오. 1. 재조합 효모 균주 구성 재조합 적격 효모 균주를 구축하기 위해, SbfI-소화된 플라스미드 K238을 관심 유전자좌(13,14)에 통합된 LexA-?…

Representative Results

~1.4kb ARS316 크로마틴 도메인의 정제는 구성적으로 발현된 LexA-TAP 어댑터 단백질에 의해 매개되었습니다. 음성 대조군으로 사용하기 위해 LexA-TAP을 발현하지만 통합 RS 및 LexA 결합 부위를 포함하지 않는 동종 균주를 사용하여 정제를 수행했습니다. 그림 3 은 ARS316 유전자좌를 표적으로 하는 대조군과 재조합 가능 균주 모두에 대해 수행된 표준 정제 실험의 DNA 분석 결과를 보여…

Discussion

특정 표적 게놈 영역의 인자 및 염색질 지형을 식별하는 것은 염색질 연구에서 계속해서 주요 과제를 제기하고 있다18. 이 프로토콜은 효모 염색체에서 뚜렷한 염색질 도메인을 특이적으로 절제하고 정제하는 효율적인 시스템을 설명합니다. 우리가 아는 한, 이 단일 단계 정제의 순도와 수율은 유전자좌 특이적 염색질 정제 방법의 많은 한계를 극복하여 다른 관련 없는 게놈 영?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

S.H. 실험실에서의 작업은 SFB1064(프로젝트 ID 213249687), 유럽 연구 위원회(ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution) 및 Helmholtz Gesellschaft를 통해 DFG의 지원을 받았습니다.

Materials

Yeast strains
Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see references 13 and 14
Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR Section 1, see reference 13 and 14
Plasmid
K238 plasmid Section 1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
K071 Spike-in plasmid DNA Section 7.1, see reference 13
Storage: Store at -20 °C
Reagents
Acetone Carl Roth 5025.1 Section 2
Storage: Store at room temperature
Ammonium acetate (NH4Ac) Sigma Aldrich A7262 Section 6 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Ammonium solution (NH4OH) 25% Merck Millipore 533003 Section 6
Storage: Store at room temperature
Ammonium sulfate Santa Cruz Sc-29085 Section 2
Storage: Store at room temperature
Bacto agar BD (VWR) 90000-760 Section 3
Storage: Store at room temperature
Bacto peptone BD (VWR) 211820 Section 3
Storage: Store at room temperature
β-Mercaptoethanol Sigma Aldrich 07604 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Chemiluminescent substrate kit ThermoFisher 34580 Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate Merck 1.06579.1000 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Dithiothreitol (DTT) ThermoFisher 15508013 Section 4
Storage: Store at 4 °C
Ethanol Merck 100983 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich ED Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Galactose (20% (w/v) stock) Sigma Aldrich G0625-1KG  /  5KG Section 3
Storage: Store at room temperature
Gel loading dye (6x) BioLabs B7024A Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Glusose Sigma-Aldrich G8270 Section
Storage: Store at room temperature
Glycine Carl Roth .0079.4 Section 2
Storage: Store at room temperature
Glycogen (5 mg/mL) Invitrogen AM9510 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl) PanReac AppliChem 182109.1211 Section 2, 4 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Magnesium Acetate (MgAc) Bernd Kraft 15274.2600/C035 Section 4
Storage: Store at room temperature
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma Aldrich M8266 Section 6
Storage: Store at room temperature
Nu PAGE LDS sample buffer (4x) Invitrogen 2399549 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) Invitrogen 15593-031 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
Potassium chloride (KCl) Sigma P9541 Section 4
Storage: Store at room temperature
Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) Hartmann Analytic SRP-203 Section 7.1
Storage: Store at 4 °C
RadPrime labeling system ThermoFisher 18428-011 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Raffinose (20% (w/v) stock) SERVA 34140.03 Section 3
Storage: Store at room temperature
Sodium chloride (NaCl) Merck K53710504142 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium citrate (Na3C6H5O7) Sigma-Aldrich 71402 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium hydroxide (NaOH) Sigma Aldrich S5881 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) Alfa Aesar A11183 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium phosphate monobasic Sigma-Aldrich 71496 Section 2 and 7.1
Storage: Store at room temperature
Sodium azide Santa Cruz Biotechnology sc-208393 Section 2
Storage: Store at -20 °C
 Triethylamine Sigma Aldrich 90340 Section 2
Storage: Store at room temperature
Tris base Chem Cruz SC-3715B Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 Section 2 and 4
Storage: Store at room temperature
Tween-20 Bernd Kraft 18014332 Section 4
Storage: Store at room temperature
Yeast extract BD (VWR) 212720 Section 3
Storage: Store at room temperature
Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock )  Biomol Y2016.5 Section 3
Storage: Store at -20 °C
Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE Sigma Aldrich Y1376 Section 1, see reference 14
Enzymes
HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) NEB R0105S Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) ThermoFisher Scientific 78446 Section 4
Storage: Store at4 °C
Proteinase K (10 mg/mL) SERVA 33756 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
RNase A (10 mg/mL)  ThermoFisher EN0531 Section 7.1
Storage: Store at -20 °C
TEV protease (10000 U/µL) NEB P8112S Section 5
Storage: Store at -20 °C
Materials
BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads Bioclone Inc. FC-102 Section 2
Storage: Store at 4 °C
Dry ice Section 4
Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL Eppendorf 22431102 Section 4
Microspin G-25 Columns Cytiva 27-5325-01 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Parafilm Merck P7793 Section 4
Positive nylon membrane Biozol 11MEMP0001 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
PVDF transfer membrane Immobilon-Merck Millipore IPVH00010 Section 7.2
Storage: Store at room temperature
SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) Invitrogen  NP0336BOX Section 7.2
Storage: Store at 4 °C
Syringe (25 mL) with luer fitting Henke Sass Wolf 4200-000V0 Section 3
Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) Cytiva 3030-917 Section 7.1
Storage: Store at room temperature
Antibodies
Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody Merck Millipore 06-719 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate Invitrogen G21234 Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins Sigma Aldrich P1291-500UL Section 7.2
Storage: Store at -20 °C
Rabbit IgG antibodies Sigma I5006-100MG Section 2
Storage: Store at 4 °C
Primers (10 µM)
ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT Section 7.1
K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT Section 7.1
PCR fragment from yeast genomic DNA as a template  for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT                                                  rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT Section 7.1
PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT Section 7.1
Equipment
Coffee grinder Gastroback 42601 Section 4
Dewar flask NAL GENE 4150-2000 Section 3
DynaMag TM-2 magnetic rack Invitrogen 12321D Section 4, 5 and 6
Hybridization oven Hybaid Mini10 Ri418 Section 2
Microcentrifuge Eppendorf 5424R Section 4 and 7.1
UV-crosslinker Analytikjena 95-0174-02 Section 7.1

Referencias

  1. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome. Cell. 98 (3), 285-294 (1999).
  2. Gauchier, M., van Mierlo, G., Vermeulen, M., Déjardin, J. Purification and enrichment of specific chromatin loci. Nature Methods. 17 (4), 380-389 (2020).
  3. Korthout, T., et al. Decoding the chromatin proteome of a single genomic locus by DNA sequencing. PLoS Biology. 16 (7), e2005542 (2018).
  4. Antão, J. M., Mason, J. M., Déjardin, J., Kingston, R. E. Protein landscape at Drosophila melanogaster telomere-associated sequence repeats. Molecular and Cellular Biology. 32 (12), 2170-2182 (2012).
  5. Déjardin, J., Kingston, R. E. Purification of proteins associated with specific genomic loci. Cell. 136 (1), 175-186 (2009).
  6. Ide, S., Dejardin, J. End-targeting proteomics of isolated chromatin segments of a mammalian ribosomal RNA gene promoter. Nature Communications. 6, 6674 (2015).
  7. Unnikrishnan, A., Gafken, P. R., Tsukiyama, T. Dynamic changes in histone acetylation regulate origins of DNA replication. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 430 (2010).
  8. Buxton, K. E., et al. Elucidating protein-DNA interactions in human alphoid chromatin via hybridization capture and mass spectrometry. Journal of Proteome Research. 16 (9), 3433-3442 (2017).
  9. Kennedy-Darling, J., et al. Discovery of chromatin-associated proteins via sequence-specific capture and mass spectrometric protein identification in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Proteome Research. 13 (8), 3810-3825 (2014).
  10. Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355, 7111 (2017).
  11. Hamperl, S., et al. Purification of specific chromatin domains from single-copy gene loci in Saccharomyces cerevisiae. Functional Analysis of DNA and Chromatin. 1094, 329-341 (2014).
  12. Hamperl, S., et al. Compositional and structural analysis of selected chromosomal domains from Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Research. 42 (1), 2 (2014).
  13. Weiβ, M. Single-copy locus proteomics of early- and late-firing DNA replication origins identifies a role of Ask1/DASH complex in replication timing control. Cell Reports. 42 (2), 112045 (2023).
  14. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
  15. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  16. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  17. Western blot membrane stripping for restaining protocol. Abcam Available from: https://www.abcam.com/protocols/western-blot-membrane-stripping-for-restaining-protocol (2023)
  18. Vermeulen, M., Déjardin, J. Locus-specific chromatin isolation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 21 (5), 249-250 (2020).

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Citar este artículo
Sajid, A., Hamperl, S. Single-Copy Gene Locus Chromatin Purification in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (201), e65460, doi:10.3791/65460 (2023).

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