Purificación de cromatina del locus del gen de copia única en Saccharomyces cerevisiae

La organización dinámica de los genomas eucariotas en cromatina compacta el ADN para que quepa dentro de los confines del núcleo, al tiempo que garantiza una dinámica suficiente para la expresión génica y la accesibilidad para los factores reguladores. En parte, esta versatilidad está mediada por el nucleosoma, la unidad básica de la cromatina, que comprende una partícula central con 147 pb de ADN envuelto ~ 1,7 veces alrededor del octámero^de histonas 1. El nucleosoma es una estructura altamente dinámica con respecto a su composición, con numerosas variantes de histonas y modificaciones postraduccionales (PTM) en las colas de histonas N- y C-terminales. Además, la cromatina eucariota interactúa con una multitud de otros componentes esenciales, como factores de transcripción, maquinaria de procesamiento de ADN y ARN, proteínas arquitectónicas, enzimas involucradas en la remodelación y modificación de la cromatina y moléculas de ARN asociadas con la cromatina. Estas maquinarias cruciales involucradas en la transcripción, replicación y reparación requieren acceso a la cromatina, que sirve como sustrato natural para estos procesos. En consecuencia, la comprensión de los mecanismos moleculares que subyacen a estas transacciones de ADN requiere una definición precisa de las alteraciones colectivas en la estructura de la cromatina en las regiones genómicas específicas donde estas maquinarias convergen y facilitan las reacciones biológicas.

A pesar de la identificación de numerosos factores de cromatina a través de estudios genéticos y de interacción proteína-proteína, la realización de análisis directos, imparciales y exhaustivos de las interacciones de la cromatina en sitios genómicos particulares ha seguido siendo un obstáculo importante ^2,3. Inicialmente, solo se pudieron aislar regiones muy abundantes del genoma (es decir, loci repetitivos) o plásmidos de copia múltiple en cantidades y pureza suficientes para la identificación por espectrometría de masas de las proteínas asociadas 4,5,6,7. Una serie de nuevos enfoques basados en la hibridación directa de sondas de captura con ADN cromatinizado, la biotinilación de proximidad mediante el sistema CRISPR-dCas9 o la unión de proteínas adaptadoras específicas de secuencia al locus de interés han comenzado a desentrañar el proteoma de loci de copia única de genomas de levaduras y mamíferos ^8,9,10. Sin embargo, todos estos métodos requieren reticulación de formaldehído para estabilizar las interacciones proteína-ADN y sonicación para solubilizar la cromatina para su posterior purificación. Juntas, ambas manipulaciones excluyen la posibilidad de estudios estructurales y funcionales posteriores de la cromatina purificada.

Para superar estas limitaciones, previamente ideamos una metodología que emplea la recombinación específica del sitio para extraer dominios cromosómicos específicos de la levadura^11,12. En esencia, la región genómica de interés está rodeada por sitios de reconocimiento (RS) para la R-recombinasa específica del sitio de Zygosaccharomyces rouxi, mientras que simultáneamente incorpora un grupo de tres sitios de unión al ADN para la proteína LexA represora transcripcional procariota (LexA) dentro de la misma región. Las células de levadura contienen un casete de expresión para la expresión simultánea de R-recombinasa y una proteína LexA fusionada a una etiqueta de purificación de afinidad en tándem (TAP). Después de la inducción de la R-recombinasa, la enzima extirpa eficientemente la región objetivo del cromosoma en forma de un dominio circular de cromatina. Este dominio se puede purificar a través de la proteína adaptadora LexA-TAP, que se une a los sitios de unión del ADN LexA, así como a un soporte de afinidad. Este método se ha utilizado recientemente para aislar distintos dominios de cromatina que contienen orígenes de replicación seleccionados del cromosoma III¹³ de levadura.

Una de las principales ventajas de este enfoque ex vivo es que permite realizar análisis funcionales del material aislado. Por ejemplo, los dominios de origen de replicación purificados con este método pueden someterse a ensayos de replicación in vitro para evaluar la eficiencia de la cocción de origen en un tubo de ensayo a partir de plantillas de cromatina ensambladas in vivo nativas. En última instancia, la caracterización bioquímica y funcional del material aislado puede permitir la reconstitución de procesos nucleares utilizando proteínas purificadas junto con la plantilla de cromatina nativa. En resumen, esta metodología abre una vía emocionante en la investigación de la cromatina, ya que será posible seguir los cambios colectivos en la composición y la estructura de la cromatina de una región genómica específica que sufre una determinada transacción cromosómica.