出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)におけるシングルコピー遺伝子座クロマチン精製
Summary
このプロトコルは出芽のイースト、Saccharomycesのcerevisiaeからの原産のchromatinの文脈の興味の単一コピー遺伝子座を浄化するために場所特定の組換えに基づいて位置特定のchromatinの隔離方法を示す。
Abstract
真核生物のクロマチンの基本的な組織単位はヌクレオソームコア粒子(NCP)であり、ヒストン八量体に~1.7倍巻き付けられたDNAで構成されています。クロマチンは、NCPや、転写因子、クロマチンリモデリング、修飾酵素など、他の多くのタンパク質複合体の実体として定義されています。これらのタンパク質-DNA相互作用が、細胞周期のさまざまな段階で特定のゲノム遺伝子座のレベルでどのように調整されるかはまだ不明です。これは主に、このような動的相互作用の正確な測定値を得ることが困難になっている現在の技術的制限によるものです。ここでは、サイト特異的組換えと効率的なシングルステップアフィニティー精製プロトコルを組み合わせて、ネイティブクロマチン状態で目的の単一コピー遺伝子座を単離する改良された方法について説明します。この分析法は、ゲノムクロマチン上の標的遺伝子座の強固な濃縮を可能にするため、この手法は、質量分析などによって、偏りのない体系的な方法でタンパク質相互作用を同定および定量するための効果的な戦略となります。このような組成分析に加えて、この方法で精製された天然クロマチンは、ヌクレオソームの位置とヒストン修飾に関する in vivo の状況を反映している可能性が高いため、酵母のほぼすべてのゲノム遺伝子座に由来するクロマチンのさらなる構造および生化学的分析に適しています。
Introduction
真核生物のゲノムをクロマチンに動的に組織化することで、DNAが核の範囲内に収められるように圧縮され、遺伝子発現に十分な動態と調節因子へのアクセス性が確保されます。この汎用性の一部は、クロマチンの基本単位であるヌクレオソームによって媒介されており、このヌクレオソームは、ヒストン八量体1の周囲に1~1.7倍のDNAが包まれたコア粒子で構成されています。ヌクレオソームは、その組成に関して非常にダイナミックな構造であり、N末端およびC末端のヒストンテールに多数のヒストン変異体と翻訳後修飾(PTM)があります。さらに、真核生物のクロマチンは、転写因子、DNAおよびRNAプロセシング機構、建築タンパク質、クロマチンのリモデリングおよび修飾に関与する酵素、クロマチンに関連するRNA分子など、他の多くの必須成分と相互作用します。転写、複製、修復に関与するこれらの重要な機構はすべて、これらのプロセスの天然基質として機能するクロマチンへのアクセスを必要とします。したがって、これらのDNAトランザクションの根底にある分子メカニズムを理解するには、これらの機構が収束し、生物学的反応を促進する特定のゲノム領域におけるクロマチン構造の集団的変化を正確に定義する必要があります。
遺伝学やタンパク質間相互作用の研究を通じて多数のクロマチン因子が同定されているにもかかわらず、特定のゲノム部位におけるクロマチン相互作用の直接的、偏りのない、包括的な分析を行うことは、依然として大きな障害となっています2,3。当初は、ゲノムの非常に豊富な領域(すなわち、反復遺伝子座)またはマルチコピープラスミドのみが、関連するタンパク質の質量分析同定に十分な量と純度で単離できました4,5,6,7。捕捉プローブのクロマチン化DNAへの直接ハイブリダイゼーション、CRISPR-dCas9システムを用いた近接ビオチン化、または配列特異的アダプタータンパク質の目的遺伝子座への結合に基づく一連の新しいアプローチにより、酵母および哺乳類のゲノムからのシングルコピー遺伝子座のプロテオームが解明され始めています8,9,10.しかし、これらすべての方法では、タンパク質とDNAの相互作用を安定化させるためのホルムアルデヒド架橋と、その後の精製のためにクロマチンを可溶化するための超音波処理が必要です。一緒に、両方の操作は、精製されたクロマチンのその後の構造的および機能的研究の可能性を排除する。
これらの限界を克服するために、我々は以前、酵母から標的染色体ドメインを抽出するために部位特異的組換えを採用する方法論を考案した11,12。要するに、関心のあるゲノム領域は、Zygosaccharomyces rouxi由来の部位特異的R-リコンビナーゼの認識部位(RS)に囲まれており、同時に原核生物の転写リプレッサーLexAタンパク質(LexA)の3つのDNA結合部位のグループを同じ領域内に組み込んでいます。酵母細胞には、R-リコンビナーゼとLexAタンパク質を同時に発現するための発現カセットが含まれており、タンデムアフィニティー精製(TAP)タグに融合しています。R-リコンビナーゼの誘導後、酵素は環状クロマチンドメインの形で染色体から標的領域を効率的に切除します。このドメインは、LexA DNA結合部位、およびアフィニティー担体に結合するLexA-TAPアダプタータンパク質を介して精製できます。この方法は、酵母染色体IIIの選択された複製起点を含む異なるクロマチンドメインを単離するために最近使用されています13。
この ex vivo アプローチの大きな利点の1つは、単離された材料の機能分析を可能にすることです。例えば、この方法で精製された複製起点ドメインを in vitro 複製アッセイに供して、天然の in vivo で組み立てられたクロマチンテンプレートから試験管内での起点焼成の効率を評価することができます。最終的に、単離された物質の生化学的および機能的特性評価により、精製されたタンパク質と天然クロマチンテンプレートを使用して核プロセスを再構成できる可能性があります。要約すると、この方法論は、特定の染色体トランザクションを受けている特定のゲノム領域の集合的な組成および構造クロマチンの変化を追跡することが可能になるため、クロマチン研究にエキサイティングな道を開きます。
Protocol
Representative Results
Discussion
特定の標的ゲノム領域の因子とクロマチンランドスケープの同定は、クロマチン研究において大きな課題を提起し続けています18。このプロトコルはとりわけイースト染色体からの明瞭なchromatinの範囲を切除し、浄化する有効なシステムを記述する。私たちの知る限り、このシングルステップ精製の純度と収率は、遺伝子座特異的なクロマチン精製法の多くの制限を克服し?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.H.研究所での作業は、SFB1064(プロジェクトID 213249687)、欧州研究会議(ERC Starting Grant 852798 ConflictResolution)、およびHelmholtz Gesellschaftを通じてDFGの支援を受けました。
Materials
| Yeast strains | |||
| Control Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, see references 13 and 14 | ||
| Recombination Strain: MATa; ura3Δ0; leu2Δ0; his3Δ1; met15Δ0; bar1::kanMX4; RS_LEXA_NS-3_ARS316_NS+3_RS; Chr I 212kb::LEU2 pTEF2-LEXA-TAP pGAL1-10 RecR | Section 1, see reference 13 and 14 | ||
| Plasmid | |||
| K238 plasmid | Section 1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C |
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| K071 Spike-in plasmid DNA | Section 7.1, see reference 13 Storage: Store at -20 °C |
||
| Reagents | |||
| Acetone | Carl Roth | 5025.1 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium acetate (NH4Ac) | Sigma Aldrich | A7262 | Section 6 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium solution (NH4OH) 25% | Merck Millipore | 533003 | Section 6 Storage: Store at room temperature |
| Ammonium sulfate | Santa Cruz | Sc-29085 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Bacto agar | BD (VWR) | 90000-760 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Bacto peptone | BD (VWR) | 211820 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| β-Mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 07604 | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Chemiluminescent substrate kit | ThermoFisher | 34580 | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Di-Sodium Hydrogen phosphate dodecahydrate | Merck | 1.06579.1000 | Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Dithiothreitol (DTT) | ThermoFisher | 15508013 | Section 4 Storage: Store at 4 °C |
| Ethanol | Merck | 100983 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | ED | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Galactose (20% (w/v) stock) | Sigma Aldrich | G0625-1KG / 5KG | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Gel loading dye (6x) | BioLabs | B7024A | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Glusose | Sigma-Aldrich | G8270 | Section Storage: Store at room temperature |
| Glycine | Carl Roth | .0079.4 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Glycogen (5 mg/mL) | Invitrogen | AM9510 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Hydrochloric acid (HCl) | PanReac AppliChem | 182109.1211 | Section 2, 4 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Magnesium Acetate (MgAc) | Bernd Kraft | 15274.2600/C035 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M8266 | Section 6 Storage: Store at room temperature |
| Nu PAGE LDS sample buffer (4x) | Invitrogen | 2399549 | Section 7.2 Storage: Store at room temperature |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1 v/v) | Invitrogen | 15593-031 | Section 7.1 Storage: Store at 4 °C |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P9541 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Radioactively labeled α-32P dATP (3,000 Ci/mmol, 10 mCi/mL) | Hartmann Analytic | SRP-203 | Section 7.1 Storage: Store at 4 °C |
| RadPrime labeling system | ThermoFisher | 18428-011 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Raffinose (20% (w/v) stock) | SERVA | 34140.03 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Sodium chloride (NaCl) | Merck | K53710504142 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium citrate (Na3C6H5O7) | Sigma-Aldrich | 71402 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | S5881 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium n-dodecyl sulfate (SDS) (5% stock (w/v) ) | Alfa Aesar | A11183 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | 71496 | Section 2 and 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Sodium azide | Santa Cruz Biotechnology | sc-208393 | Section 2 Storage: Store at -20 °C |
| Triethylamine | Sigma Aldrich | 90340 | Section 2 Storage: Store at room temperature |
| Tris base | Chem Cruz | SC-3715B | Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | Section 2 and 4 Storage: Store at room temperature |
| Tween-20 | Bernd Kraft | 18014332 | Section 4 Storage: Store at room temperature |
| Yeast extract | BD (VWR) | 212720 | Section 3 Storage: Store at room temperature |
| Yeast mating factor alpha (1 µg/mL stock ) | Biomol | Y2016.5 | Section 3 Storage: Store at -20 °C |
| Yeast Synthetic Drop-out medium Supplements without LEUCINE | Sigma Aldrich | Y1376 | Section 1, see reference 14 |
| Enzymes | |||
| HpaI restriction enzyme (5,000 U/mL) | NEB | R0105S | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x) | ThermoFisher Scientific | 78446 | Section 4 Storage: Store at4 °C |
| Proteinase K (10 mg/mL) | SERVA | 33756 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| RNase A (10 mg/mL) | ThermoFisher | EN0531 | Section 7.1 Storage: Store at -20 °C |
| TEV protease (10000 U/µL) | NEB | P8112S | Section 5 Storage: Store at -20 °C |
| Materials | |||
| BcMag Epoxy-Activated Magnetic Beads | Bioclone Inc. | FC-102 | Section 2 Storage: Store at 4 °C |
| Dry ice | Section 4 | ||
| Low-binding centrifuge tubes 2.0 mL | Eppendorf | 22431102 | Section 4 |
| Microspin G-25 Columns | Cytiva | 27-5325-01 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Parafilm | Merck | P7793 | Section 4 |
| Positive nylon membrane | Biozol | 11MEMP0001 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| PVDF transfer membrane | Immobilon-Merck Millipore | IPVH00010 | Section 7.2 Storage: Store at room temperature |
| SDS-PAGE gel 4-12% bis-tris (15 well, 1.5 mm) | Invitrogen | NP0336BOX | Section 7.2 Storage: Store at 4 °C |
| Syringe (25 mL) with luer fitting | Henke Sass Wolf | 4200-000V0 | Section 3 |
| Whatman paper (Grade 3MM CHR Cellulose Western Blotting Paper Sheet) | Cytiva | 3030-917 | Section 7.1 Storage: Store at room temperature |
| Antibodies | |||
| Anti-LexA, rabbit polyclonal IgG, DNA binding region antibody | Merck Millipore | 06-719 | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Goat Anti-Rabbit IgG (H+L), Horseradish peroxidase conjugate | Invitrogen | G21234 | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Peroxidase Anti-Peroxidase (PAP) antibody produced in rabbit for the detection of TAP-tagged proteins | Sigma Aldrich | P1291-500UL | Section 7.2 Storage: Store at -20 °C |
| Rabbit IgG antibodies | Sigma | I5006-100MG | Section 2 Storage: Store at 4 °C |
| Primers (10 µM) | |||
| ARS316: fwd 5'- CGGCATTATCGTACACAACCT, rev 5'- GTTCTTCGTTGCCTACATTTTCT | Section 7.1 | ||
| K071 Spike-in plasmid DNA: fwd: 5'-TTTTCGCTGCTTGTCCTTTT, rev 5'- CATTTTCGTCCTCCCAACAT | Section 7.1 | ||
| PCR fragment from yeast genomic DNA as a template for ARS316 amplification (for southern blot): fwd 5’- AAATTCTGCCCTTGATTCGT rev 5’- TTTGTTTATCTCATCACTAAT | Section 7.1 | ||
| PDC1: fwd 5'- CATGATCAGATGGGGCTTCA, rev 5'-ACCGGTGGTAGCGACTCTGT | Section 7.1 | ||
| Equipment | |||
| Coffee grinder | Gastroback | 42601 | Section 4 |
| Dewar flask | NAL GENE | 4150-2000 | Section 3 |
| DynaMag TM-2 magnetic rack | Invitrogen | 12321D | Section 4, 5 and 6 |
| Hybridization oven | Hybaid Mini10 | Ri418 | Section 2 |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | Section 4 and 7.1 |
| UV-crosslinker | Analytikjena | 95-0174-02 | Section 7.1 |
Referencias
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