Modèle d’arrêt cardiaque chez la souris pour l’imagerie cérébrale et la surveillance de la physiologie cérébrale pendant l’ischémie et la réanimation

L’arrêt cardiaque (AC) reste une crise de santé publique mondiale¹. Plus de 356 000 cas d’AC en dehors de l’hôpital et 290 000 cas d’AC à l’hôpital sont signalés chaque année aux États-Unis seulement, et la plupart des victimes d’AC ont plus de 60 ans. Notamment, les déficiences neurologiques post-AC sont fréquentes chez les survivants, et celles-ci représentent un défi majeur pour la prise en charge de l’AC 2,3,4,5. Pour comprendre les changements pathologiques cérébraux post-AC et leurs effets sur les résultats neurologiques, diverses techniques de surveillance neurophysiologique et de surveillance des tissus cérébraux ont été appliquées chez les patients 6,7,8,9,10,11,12. À l’aide de la spectroscopie proche infrarouge, une surveillance cérébrale en temps réel a également été effectuée chez des rats AC pour prédire les résultats neurologiques¹³.

Cependant, dans les modèles murins d’AC, une telle approche d’imagerie a été compliquée par la nécessité de compressions thoraciques pour rétablir la circulation spontanée, ce qui implique toujours un mouvement physique important et, par conséquent, entrave les procédures d’imagerie délicates. De plus, les modèles d’AC sont normalement réalisés avec des souris en décubitus dorsal, alors que les souris doivent être tournées en position couchée pour de nombreuses modalités d’imagerie cérébrale. Ainsi, un modèle de souris avec un mouvement corporel minimal pendant la chirurgie est nécessaire dans de nombreux cas afin d’effectuer une imagerie/surveillance en temps réel du cerveau pendant toute la procédure d’AC, allant de la pré-AC à la post-réanimation.

Auparavant, Zhang et al. ont rapporté un modèle d’AC de souris qui pourrait être utile pour l’imagerie cérébrale¹⁴. Dans leur modèle, l’AC a été induite par des injections en bolus de vecuronium et d’esmolol suivies de l’arrêt de la ventilation mécanique. Ils ont montré qu’après 5 min d’AC, la réanimation pouvait être réalisée par perfusion d’un mélange de réanimation. Notamment, cependant, l’arrêt circulatoire dans leur modèle ne s’est produit qu’environ 10 s après l’injection d’esmolol. Ainsi, ce modèle ne récapitule pas la progression de l’AC induite par l’asphyxie chez les patients, y compris l’hypercapnie et l’hypoxie tissulaire pendant la période précédant l’arrêt.

L’objectif global de l’intervention chirurgicale actuelle est de modéliser l’AC d’asphyxie clinique chez la souris, suivie d’une réanimation sans compressions thoraciques. Ce modèle d’AC permet donc l’utilisation de techniques d’imagerie complexes pour étudier la physiologie du cerveau chez la souris¹⁵.

Toutes les procédures décrites ici ont été menées conformément aux directives des National Institutes of Health (NIH) pour le soin et l’utilisation des animaux dans la recherche, et le protocole a été approuvé par le Duke Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC). Des souris mâles et femelles C57BL/6 âgées de 8 à 10 semaines ont été utilisées pour la présente étude.

1. Préparation chirurgicale

1. Pesez une souris sur une balance numérique et placez-la dans une boîte d’induction d’anesthésie en plexiglas de 4 po x 4 po x 7 po.
2. Réglez le vaporisateur d’anesthésie à 5 % d’isoflurane, le débitmètre d’oxygène à 30 et le débitmètre d’azote à 70 (voir le tableau des matériaux).
3. Sortez l’animal de la boîte d’induction et allongez-le en décubitus dorsal sur le banc d’opération lorsque sa fréquence respiratoire a diminué à 30-40 respirations par minute.
4. Retirez la langue à l’aide d’une pince émoussée et tenez-la à l’aide de la main non dominante. Utilisez la main dominante pour insérer un laryngoscope (voir le tableau des matériaux) dans la bouche de la souris et visualisez la corde vocale.
5. Utilisez la main non dominante pour insérer un fil-guide et un cathéter intraveineux de 20 G dans la bouche. Insérez délicatement le fil guide dans la trachée.
6. Poussez le cathéter dans la trachée jusqu’à ce que la partie aile du cathéter soit au même niveau que l’extrémité du nez.
   REMARQUE : N’intubez pas une souris qui n’est pas complètement anesthésiée car cela pourrait blesser la trachée et provoquer des saignements des voies respiratoires.
7. Connectez la souris intubée à un ventilateur pour petits animaux (voir le tableau des matériaux) et réduisez l’isoflurane à 1,5 %.
8. Entrez le poids corporel de la souris dans le panneau de commande du ventilateur pour déterminer le volume courant et la fréquence respiratoire.
9. Gardez la souris en décubitus dorsal sous une lampe chauffante et maintenez la température rectale à 37 °C à l’aide d’un régulateur de température.
10. Rasez les zones inguinales, désinfectez la zone chirurgicale au moins trois fois avec de l’iode et de l’alcool (voir le tableau des matériaux) et couvrez la zone avec un champ chirurgical stérile.
11. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux et administrez 5 mg/kg de carprofène par voie sous-cutanée avant la chirurgie.
12. Ouvrez l’emballage de l’instrument stérile pour la chirurgie. Faites une incision cutanée de 1 cm avec des ciseaux chirurgicaux pour accéder aux artères fémorales des deux côtés. Disséquez et ligaturez l’artère fémorale distale avec un seul brin de suture en soie 4-0 (voir le tableau des matériaux) et appliquez une goutte de lidocaïne.
13. Appliquez un clip d’anévrisme au niveau de l’artère fémorale proximale et faites une petite incision sur l’artère distale au clip. Insérez un cathéter en polyéthylène 10 (PE-10, voir le tableau des matériaux) dans les artères fémorales gauche et droite.
    REMARQUE : Le cathéter artériel gauche est utilisé pour la surveillance de la pression artérielle, tandis que le droit est utilisé pour le prélèvement sanguin et la perfusion de mélange de réanimation.
14. Injecter 50 μL de solution saline héparinée 1 :10 dans chaque ligne artérielle pour prévenir la coagulation dans la ligne.
15. Tournez la souris en position couchée et montez-la sur un chevalement stéréotaxique.
16. Connectez trois électrodes à aiguille (rouge, verte et noire) au bras gauche, à la jambe gauche et au bras droit pour la surveillance de l’électrocardiogramme (ECG, voir le tableau des matériaux).
17. Collez une sonde en fibre plastique flexible sur le crâne temporal intact à travers une incision cutanée de 0,5 cm pour surveiller le flux sanguin cérébral. Cette étape est facultative.
18. Rasez le haut de la tête, désinfectez la zone chirurgicale au moins trois fois avec de l’iode et de l’alcool et couvrez la zone avec un champ chirurgical stérile.
19. Coupez une incision cutanée médiane de 2,5 cm et utilisez quatre petits écarteurs pour exposer toute la surface du crâne pour l’imagerie cérébrale.
20. Placez un imageur de surveillance (p. ex., un imageur à contraste laser avec chatoiement, voir le tableau des matériaux) au-dessus de la tête.
    REMARQUE : Quelques gouttes de solution saline peuvent être ajoutées à la surface du crâne pour faciliter l’imagerie par contraste de chatoiement laser.

2. Induction de l’arrêt cardiaque

1. Remplir une seringue en plastique de 1 mL avec 26 μL de solution mère de cocktail de réanimation.
   REMARQUE : Chaque millilitre de cette solution contient 400 μL d’épinéphrine à 1 mg/mL, 500 μL de bicarbonate de sodium à 8,4 %, 50 μL d’héparine à 1 000 U/mL et 50 μL de chlorure de sodium à 0,9 % (voir le tableau des matériaux).
2. Attendez que la température corporelle atteigne 37 °C. Ajustez le compteur d’oxygène à 100% pour oxygéner le sang pendant 2 min.
3. Prélever le sang artériel oxygéné jusqu’à 200 μL par l’artère fémorale droite dans la seringue en plastique préparée contenant 26 μL de solution mère de cocktail de réanimation.
4. Coupez l’oxygène et augmentez l’azote à 100% pour induire l’anoxie.
   REMARQUE : Après environ 45 s, le cœur ne fonctionnera plus et la fréquence cardiaque diminuera rapidement, indiquant l’apparition de l’AC. Après environ 2 minutes de privation d’oxygène, la surveillance de l’ECG indiquera une asystole, et il n’y aura pas de pression artérielle systémique mesurable et de flux sanguin cérébral négligeable.
5. Éteignez le ventilateur, le vaporisateur d’isoflurane, le régulateur de température et le débitmètre d’azote. Ajustez l’oxygène à 100 % en vue de la réanimation.

3. Procédure de réanimation

1. Allumez le ventilateur 8 min après l’apparition de l’AC.
2. Commencez immédiatement à perfuser le sang oxygéné prélevé mélangé au cocktail de réanimation dans la circulation sanguine via l’artère fémorale droite en 1 min.
   REMARQUE : La perfusion entraîne une augmentation progressive de la fréquence cardiaque et le rétablissement de la perfusion sanguine ; Finalement, le retour de la circulation spontanée (ROSC) est atteint.

4. Récupération post-AC

1. Placez la souris en décubitus dorsal après l’avoir retirée du cadre stéréotaxique et retirez les cathéters PE-10 des artères fémorales.
2. Appliquez 0,25 % de bupivacaïne sur l’incision cutanée et suturez les incisions cutanées à l’aide d’une suture en nylon 6-0 (voir le tableau des matériaux). Appliquez une pommade antibiotique à la surface de l’incision cutanée.
3. Débranchez le ventilateur de la souris lorsque la respiration spontanée est rétablie.
4. Transférez la souris dans une chambre de récupération à une température contrôlée de 32 °C.
5. Après 2 h de récupération, extubez la souris et retournez dans la cage d’accueil. Injecter 0,5 mL de solution saline normale par voie sous-cutanée pour prévenir la déshydratation.

Pour induire l’AC, la souris a été anesthésiée avec de l’isoflurane à 1,5 % et ventilée avec de l’azote à 100 %. Cette affection a entraîné une bradycardie sévère en 45 s (Figure 1). Après 2 minutes d’anoxie, la fréquence cardiaque a considérablement diminué (Figure 2), la pression artérielle est descendue en dessous de 20 mmHg et le flux sanguin cérébral a complètement cessé (Figure 1). Lorsque l’isoflurane a été désactivé, la température corporelle n’a plus été gérée et a lentement chuté à environ 32 °C à la fin de l’AC (figure 1).

Immédiatement après 8 min d’AC, le ventilateur a été mis en marche et la souris a été alimentée en oxygène à 100 %. Le mélange sang-réanimation a été perfusé dans la circulation via le cathéter artériel. Peu de temps après l’injection du mélange sang-réanimation, la fonction cardiaque a commencé à se rétablir. Après un court intervalle, le flux sanguin systémique et cérébral a été rétabli et le ROSC a été établi. Le taux de réussite du ROSC est de près de 100% dans notre laboratoire. Ce modèle a été réalisé avec succès chez des souris jeunes et âgées.

Grâce à ce modèle, deux modalités d’imagerie ont été utilisées dans cette étude, y compris l’imagerie par contraste laser (LSCI) et l’imagerie photoacoustique, pour surveiller le flux sanguin cérébral et l’oxygénation du sang au niveau du cerveau entier pendant l’AC et la réanimation. L’ICLS a confirmé l’absence totale de circulation sanguine dans le cerveau au cours de l’AC (Figure 3). Des changements plus détaillés dans le flux sanguin, la structure et l’oxygénation au cours de la procédure d’AC peuvent être obtenus à partir des images photoacoustiques (Figure 4).

Figure 1 : Enregistrement physiologique pendant l’AC et la réanimation. Le débit sanguin cérébral (% de la valeur initiale, mesuré par débitmétrie laser Doppler), la pression artérielle (mmHg), l’activité cardiaque (battements par minute) et la température corporelle (°C) changent avant, pendant l’AC et après l’AC. L’axe des abscisses représente l’heure en minutes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Activité cardiaque pendant l’AC et la réanimation. La fréquence cardiaque a été enregistrée en continu, et les panneaux (A), (B) et (C) sont représentatifs de la fréquence cardiaque avant, pendant l’AC et après l’AC, respectivement. L’axe des ordonnées représente les valeurs absolues de tension (mV). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Images de contraste de chatoiement laser pendant l’AC et la réanimation. Le flux sanguin cérébral global a été surveillé. L’AC a entraîné une perte complète du flux sanguin cérébral (B) par rapport à la ligne de base (A). L’hyperperfusion était présente dans le cerveau immédiatement après la réanimation (C), suivie d’une hypoperfusion pendant la phase tardive (D). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Images photoacoustiques pendant l’AC et la réanimation. Les changements vasculaires locaux ont été obtenus à l’aide de l’imagerie photoacoustique. Les artères et les branches n’ont pas été perfusées avec du sang pendant l’AC (B) par rapport à la ligne de base (A). Toutes les artères et les branches ont été perfusées immédiatement après la réanimation, y compris même de minuscules ponts entre les branches (C, flèches). Cependant, ces ponts ont disparu tardivement (D) en raison de l’hypoperfusion. La barre indique le niveau sO₂. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Dans les études expérimentales sur l’AC, l’asphyxie, les injections de chlorure de potassium ou la fibrillation ventriculaire dérivée du courant électrique ont été utilisées pour induire l’AC 16,17,18,19,20,21,22,23. Normalement, la RCP est nécessaire pour la réanimation dans ces modèles d’AC, en particulier chez la souris. Nous avons formulé un mélange de réanimation qui permet une réanimation spontanée après asphyxie CA chez la souris. L’élimination de l’étape de RCP ouvre davantage de possibilités de surveillance de la physiologie cérébrale pendant l’AC et la réanimation à l’aide des modalités d’imagerie actuelles.

Cette solution mère de cocktail de réanimation comprend du bicarbonate de sodium, de l’héparine, du sang artériel oxygéné et de l’épinéphrine. Il est bien connu que l’AC induit à la fois une acidose métabolique et une acidose respiratoire. On s’attend à ce que le bicarbonate de sodium normalise le pH dans le sang. L’héparine est un anticoagulant et est utilisée pour prévenir la formation de caillots nocifs lors de la reperfusion. Le sang oxygéné et l’épinéphrine sont les composants les plus critiques pour la réanimation dans ce modèle. Bien que les mécanismes exacts qui sous-tendent cette réanimation spontanée soient encore inconnus, on suppose que lorsqu’une quantité adéquate de sang oxygéné atteint les artères coronaires, fournissant ainsi de l’oxygène et de l’épinéphrine, la restauration de la contractilité myocardique et la génération du débit cardiaque peuvent être réalisées sans compressions thoraciques. Dans ce processus, la pression de perfusion, qui n’est réalisable que dans le système vasculaire artériel non effondré et à paroi plus épaisse, est essentielle, car elle facilite l’apport de sang oxygéné au cœur. À l’appui de cette notion, nous avons constaté que l’infusion du même mélange par la veine fémorale n’entraînait pas la restauration de la fonction cardiaque et que la réanimation ne pouvait pas être réalisée. Par conséquent, ce cocktail de réanimation doit être administré par voie artérielle pour obtenir la restauration de la fonction cardiaque sans compressions thoraciques.

La dose d’épinéphrine utilisée dans le modèle actuel est similaire à celle utilisée dans les expériences d’AC standard. Chaque millilitre de solution mère de cocktail de réanimation contient 400 μg d’épinéphrine. La seringue est préparée avec 26 μL de solution mère de cocktail de réanimation, et le sang artériel est prélevé à 200 μL dans la seringue. Comme la seringue en plastique de 1 mL a un espace mort de 60 μL à l’avant, le sang restant dans la seringue après la réanimation est de 60 μL, ce qui comprend 6 μL de solution mère de cocktail de réanimation. Ainsi, la solution mère de cocktail de réanimation injectée finale est de 20 μL chez chaque souris, ce qui représente une dose de 8 μg d’épinéphrine dans cette procédure. Dans ce protocole, la quantité de solution de réanimation n’est pas ajustée en fonction du poids corporel, comme c’est le cas en milieu clinique. Nous n’avons rencontré aucun problème de réanimation chez des souris d’un poids corporel de 20 à 32 g.

Il convient de noter que ce protocole de réanimation n’a été utilisé avec succès que dans ce modèle d’AC d’asphyxie. Dans notre étude pilote, ce protocole n’a pas réussi à réanimer les souris après une AC induite par le KCl. Ainsi, le modèle décrit ici est particulièrement utile pour étudier la physiologie cérébrale de l’asphyxie AC.

En résumé, comme ce modèle ne nécessite pas de compressions thoraciques pendant la réanimation, 1) la souris peut être maintenue en position couchée, et 2) la tête peut être montée dans un cadre stéréotaxique, permettant des mesures d’imagerie et d’électrophysiologie sans aucun mouvement pendant toute la phase d’enregistrement. Cela répond parfaitement aux exigences de l’imagerie/surveillance de la physiologie cérébrale pendant l’AC et la réanimation. Ce modèle a été utilisé avec succès dans des expériences visant à suivre dynamiquement le flux sanguin cérébral, les réponses vasculaires et l’oxygène des tissus cérébraux chez les souris AC, et ces expériences ont généré des données inestimables sur les changements vasculaires et les réponses à l’administration de médicaments chez les souris AC.