Musehjertestopmodel til hjernebilleddannelse og hjernefysiologiovervågning under iskæmi og genoplivning

Hjertestop (CA) er fortsat en global folkesundhedskrise¹. Mere end 356.000 tilfælde uden for hospitalet og 290.000 CA-tilfælde på hospitalet rapporteres årligt alene i USA, og de fleste CA-ofre er over 60 år gamle. Især er neurologiske svækkelser efter CA almindelige blandt overlevende, og disse udgør en stor udfordring for CA-styring 2,3,4,5. For at forstå post-CA hjernepatologiske ændringer og deres virkninger på neurologiske resultater er forskellige neurofysiologiske overvågnings- og hjernevævsovervågningsteknikker blevet anvendt hos patienter 6,7,8,9,10,11,12. Ved hjælp af nær-infrarød spektroskopi er hjerneovervågning i realtid også blevet udført i CA-rotter for at forudsige neurologiske resultater¹³.

I murine CA-modeller er en sådan billeddannelsesmetode imidlertid blevet kompliceret af behovet for brystkompressioner for at genoprette spontan cirkulation, hvilket altid medfører betydelig fysisk bevægelse og dermed hindrer sarte billeddannelsesprocedurer. Desuden udføres CA-modeller normalt med mus i liggende stilling, mens musene skal vendes til den udsatte position for mange hjernebilleddannelsesmetoder. Således kræves en musemodel med minimal kropsbevægelse under operationen i mange tilfælde for at udføre realtidsbilleddannelse / overvågning af hjernen under hele CA-proceduren, der spænder fra præ-CA til post-genoplivning.

Tidligere rapporterede Zhang et al. en mus CA-model, der kunne være nyttig til hjernebilleddannelse¹⁴. I deres model blev CA induceret af bolusinjektioner af vecuronium og esmolol efterfulgt af ophør af mekanisk ventilation. De viste, at efter 5 minutters CA kunne genoplivning opnås ved infusion af en genoplivningsblanding. Især forekom kredsløbsstop i deres model kun ca. 10 s efter esmololinjektionen. Denne model rekapitulerer således ikke progressionen af asfyxi-induceret CA hos patienter, herunder hyperkapni og vævshypoxi i perioden før anholdelsen.

Det overordnede mål med den nuværende kirurgiske procedure er at modellere klinisk asfyksi CA hos mus efterfulgt af genoplivning uden brystkompressioner. Denne CA-model tillader derfor brugen af komplekse billeddannelsesteknikker til at studere hjernefysiologi hos mus¹⁵.

Alle de procedurer, der er beskrevet her, blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health (NIH) retningslinjer for pleje og brug af dyr i forskning, og protokollen blev godkendt af Duke Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC). C57BL/6 han- og hunmus i alderen 8-10 uger blev anvendt til nærværende undersøgelse.

1. Kirurgisk forberedelse

1. Vej en mus på en digital vægt, og læg den i en 4 tommer x 4 tommer x 7 i plexiglasanæstesiinduktionsboks.
2. Juster anæstesifordamperen til 5% isofluran, iltflowmåleren til 30 og nitrogenflowmåleren til 70 (se materialetabel).
3. Tag dyret ud af induktionsboksen, og læg det i liggende stilling på operationsbænken, når respirationsfrekvensen er faldet til 30-40 vejrtrækninger pr. Minut.
4. Træk tungen ud med stump tang, og hold den ved hjælp af den ikke-dominerende hånd. Brug den dominerende hånd til at indsætte et laryngoskop (se Materialetabel) i musens mund og visualiser stemmebåndet.
5. Brug den ikke-dominerende hånd til at indsætte en styretråd og 20 G intravenøst kateter i munden. Indsæt forsigtigt styretråden i luftrøret.
6. Skub kateteret ind i luftrøret, indtil kateterets vingedel er jævn med næsespidsen.
   BEMÆRK: Intuberer ikke en mus, der ikke er fuldt bedøvet, da dette kan skade luftrøret og forårsage luftvejsblødning.
7. Tilslut den intuberede mus til en respirator til små dyr (se materialetabellen), og reducer isofluran til 1,5%.
8. Indtast musens kropsvægt i ventilatorens kontrolpanel for at bestemme tidevandsvolumen og respirationsfrekvens.
9. Hold musen i liggende stilling under en varmelampe, og hold rektaltemperaturen på 37 °C med en temperaturregulator.
10. Barber lyskeområderne, desinficer det kirurgiske område mindst tre gange med jod og alkohol (se materialetabellen), og dæk området med en steril kirurgisk afdækning.
11. Påfør øjensalve på begge øjne og administrer 5 mg/kg carprofen subkutant før operationen.
12. Åbn den sterile instrumentpakke til kirurgi. Lav et 1 cm hudsnit med kirurgisk saks for at få adgang til lårbensarterierne på begge sider. Disseker og ligeret den distale lårbensarterie med en enkelt streng af 4-0 silkesutur (se materialetabel), og påfør en dråbe lidokain.
13. Påfør et aneurismeklip ved den proksimale lårbensarterie og lav et lille snit på arterien distal til klippet. Indsæt et polyethylen 10 (PE-10, se materialetabel) kateter i venstre og højre lårbensarterie.
    BEMÆRK: Den venstre arterielle linje bruges til blodtryksovervågning, mens den højre bruges til blodudtagning og genoplivningsblandingsinfusion.
14. Injicer 50 μL 1:10 hepariniseret saltvand i hver arteriel linje for at forhindre koagulation i linjen.
15. Drej musen til den udsatte position, og monter den på en stereotaksisk hovedramme.
16. Tilslut tre nåleelektroder (rød, grøn og sort) til venstre arm, venstre ben og højre arm til overvågning af elektrokardiogram (EKG, se materialetabel).
17. Lim en fleksibel plastfibersonde på det intakte temporale kranium gennem et 0,5 cm hudsnit til overvågning af cerebral blodgennemstrømning. Dette trin er valgfrit.
18. Barber toppen af hovedet, desinficer det kirurgiske område mindst tre gange med jod og alkohol, og dæk området med et sterilt kirurgisk drapel.
19. Skær et 2,5 cm midterlinje hudsnit, og brug fire små retraktorer til at udsætte hele kraniets overflade for hjernebilleddannelse.
20. Placer et overvågningskamera (f.eks. et laserpletkontrastkamera, se materialetabel) over hovedet.
    BEMÆRK: Et par dråber saltvand kan tilsættes til kraniets overflade for at lette laserspeckle kontrastbilleddannelse.

2. Induktion af hjertestop

1. Fyld en 1 ml plastsprøjte med 26 μL genoplivningscocktailstamopløsning.
   BEMÆRK: Hver milliliter af denne opløsning indeholder 400 μL 1 mg / ml adrenalin, 500 μL 8,4% natriumbicarbonat, 50 μL 1,000 U / ml heparin og 50 μL 0,9% natriumchlorid (se materialetabel).
2. Vent, indtil kropstemperaturen når 37 °C. Juster iltmåleren til 100% for at ilte blodet i 2 min.
3. Træk det iltede arterielle blod op til 200 μL via højre lårbensarterie ind i den forberedte plastsprøjte, der indeholder 26 μL genoplivningscocktailstamopløsning.
4. Sluk for ilten, og øg nitrogenet til 100% for at fremkalde anoxi.
   BEMÆRK: Efter ca. 45 sek. vil hjertet ikke fungere, og hjertefrekvensen vil hurtigt falde, hvilket indikerer begyndelsen af CA. Efter ca. 2 minutters iltmangel vil EKG-overvågningen indikere en asystol, og der vil ikke være noget målbart systemisk blodtryk og ubetydelig cerebral blodgennemstrømning.
5. Sluk for ventilatoren, isofluranfordamperen, temperaturregulatoren og nitrogenflowmåleren. Juster ilten til 100% som forberedelse til genoplivning.

3. Procedure for genoplivning

1. Tænd for ventilatoren 8 minutter efter CA-start.
2. Begynd straks at tilføre det tilbagetrukne iltede blod blandet med genoplivningscocktailen i blodcirkulationen via højre lårbensarterie på 1 min.
   BEMÆRK: Infusionen fører til en gradvis stigning i hjertefrekvensen og genoprettelsen af blodperfusion; til sidst opnås tilbagevenden af spontan cirkulation (ROSC).

4. Gendannelse efter CA

1. Placer musen i liggende stilling, når du har fjernet den fra den stereotaksiske ramme, og fjern PE-10-katetrene fra lårbensarterierne.
2. Påfør 0,25% bupivacain på hudsnittet, og sutur hudsnittene ved hjælp af en 6-0 nylonsutur (se materialetabel). Påfør antibiotisk salve på overfladen af hudsnittet.
3. Afbryd musens ventilator, når spontan åndedræt genoprettes.
4. Musen overføres til et restitutionskammer med en kontrolleret temperatur på 32 °C.
5. Efter 2 timers genopretning ekstuberes musen og vender tilbage til hjemmeburet. Injicer 0,5 ml normalt saltvand subkutant for at forhindre dehydrering.

For at inducere CA blev musen bedøvet med 1,5% isofluran og ventileret med 100% nitrogen. Denne tilstand førte til alvorlig bradykardi hos 45 s (figur 1). Efter 2 minutters anoxi, hjertefrekvensen faldt dramatisk (figur 2), blodtrykket faldt til under 20 mmHg, og den cerebrale blodgennemstrømning ophørte helt (figur 1). Da isofluran blev slukket, blev kropstemperaturen ikke længere styret og faldt langsomt til ca. 32 °C ved slutningen af CA (figur 1).

Umiddelbart efter 8 minutters CA blev ventilatoren tændt, og musen blev forsynet med 100% ilt. Blodgenoplivningsblandingen blev infunderet i kredsløbet via arteriekateteret. Kort efter injektionen af blodgenoplivningsblandingen begyndte hjertefunktionen at komme sig. Efter et kort interval blev den systemiske og cerebrale blodgennemstrømning genoprettet, og ROSC blev etableret. Succesraten for ROSC er næsten 100% i vores laboratorium. Denne model er blevet udført med succes hos unge og ældre mus.

Aktiveret af denne model blev der anvendt to billeddannelsesmetoder i denne undersøgelse, herunder laserspeckle kontrastbilleddannelse (LSCI) og fotoakustisk billeddannelse, til at overvåge cerebral blodgennemstrømning og blodiltning på hele hjerneniveau under CA og genoplivning. LSCI bekræftede det fuldstændige fravær af blodgennemstrømning i hjernen under CA (figur 3). Mere detaljerede ændringer i blodgennemstrømning, struktur og iltning under CA-proceduren kan opnås fra de fotoakustiske billeder (figur 4).

Figur 1: Fysiologisk registrering under CA og genoplivning. Cerebral blodgennemstrømning (% baseline; målt med laser Doppler flowmetri), blodtryk (mmHg), hjerteaktivitet (slag pr. minut) og kropstemperatur (° C) ændres før CA, under CA og efter CA. X-aksen viser tiden i minutter. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2: Hjerteaktivitet under CA og genoplivning. Pulsen blev løbende registreret, og panelerne (A), (B) og (C) er repræsentative for pulsen før CA, under henholdsvis CA og post-CA. Y-aksen viser de absolutte spændingsværdier (mV). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3: Laserspeckle kontrastbilleder under CA og genoplivning. Global cerebral blodgennemstrømning blev overvåget. CA førte til et fuldstændigt tab af cerebral blodgennemstrømning (B) sammenlignet med baseline (A). Hyperperfusion var til stede i hjernen umiddelbart efter genoplivning (C) , og dette blev derefter efterfulgt af hypoperfusion i den sene fase (D). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Fotoakustiske billeder under CA og genoplivning. Lokale vaskulære ændringer blev tilgået ved hjælp af fotoakustisk billeddannelse. Arterierne og grenene blev ikke perfuseret med blod under CA (B) sammenlignet med baseline (A). Alle arterier og grene blev perfuseret umiddelbart efter genoplivning, herunder endda nogle små broer mellem grene (C, pile). Disse broer forsvandt imidlertid sent (D) på grund af hypoperfusion. Bjælken viser sO_2-niveauet . Klik her for at se en større version af denne figur.

I eksperimentelle CA-undersøgelser er asfyxi, kaliumchloridinjektioner eller elektrisk strømafledt ventrikelflimmer blevet anvendt til at inducere CA 16,17,18,19,20,21,22,23. Normalt kræves HLR til genoplivning i disse CA-modeller, især hos mus. Vi har formuleret en genoplivningsblanding, der muliggør spontan genoplivning efter asfyksi CA hos mus. Eliminering af HLR-trinnet åbner flere muligheder for overvågning af hjernens fysiologi under CA og genoplivning ved hjælp af nuværende billeddannelsesmetoder.

Denne genoplivningscocktailstamopløsning inkluderer natriumbicarbonat, heparin, iltet arterielt blod og adrenalin. Det er velkendt, at CA inducerer både metabolisk og respiratorisk acidose. Natriumbicarbonat forventes at normalisere pH i blodet. Heparin er et antikoagulant og bruges til at forhindre skadelig koagulationsdannelse under reperfusion. Oxygeneret blod og adrenalin er de mest kritiske komponenter til genoplivning i denne model. Selvom de nøjagtige mekanismer, der understøtter denne spontane genoplivning, stadig er ukendte, spekuleres det i, at når en tilstrækkelig mængde iltet blod når koronararterierne og dermed leverer ilt og epinephrin, kan genoprettelsen af myokardiekontraktiliteten og genereringen af hjerteudgang opnås uden brystkompressioner. I denne proces er infusionstrykket, som kun kan opnås i den ikke-kollapsede og tykkere væggede arterielle vaskulatur, kritisk, da dette letter leveringen af iltet blod til hjertet. Til støtte for denne opfattelse fandt vi, at infusion af den samme blanding via lårbensvenen ikke resulterede i genoprettelse af hjertefunktionen, og genoplivning kunne ikke opnås. Derfor skal denne genoplivningscocktail administreres gennem arterielinjen for at opnå genoprettelse af hjertefunktionen uden brystkompressioner.

Doseringen af adrenalin, der anvendes i den nuværende model, svarer til den, der anvendes i standard CA-eksperimenter. Hver milliliter genoplivningscocktailstamopløsning indeholder 400 μg adrenalin. Sprøjten fremstilles med 26 μL genoplivningscocktailstamopløsning, og arterielt blod trækkes op til 200 μL i sprøjten. Da 1 ml plastsprøjten har et 60 μL dødt rum i forenden, er blodet tilbage i sprøjten efter genoplivning 60 μL, hvilket inkluderer 6 μL genoplivningscocktailstamopløsning. Således er den endelige injicerede genoplivningscocktailstamopløsning 20 μL i hver mus, hvilket repræsenterer en dosis på 8 μg epinephrin i denne procedure. I denne protokol justeres mængden af genoplivningsopløsning ikke i henhold til kropsvægten, svarende til i kliniske indstillinger. Vi har ikke oplevet genoplivningsproblemer hos mus med en kropsvægt på 20-32 g.

Bemærk, at denne genoplivningsprotokol kun blev brugt med succes i denne asfyksi CA-model. I vores pilotundersøgelse kunne denne protokol ikke genoplive mus efter KCl-induceret CA. Således er modellen beskrevet her specifikt nyttig til at studere hjernefysiologien af asfyxi CA.

Sammenfattende, da denne model ikke kræver brystkompressioner under genoplivning, 1) musen kan holdes i den udsatte position, og 2) hovedet kan monteres i en stereotaksisk hovedramme, hvilket muliggør billeddannelse og elektrofysiologiske målinger uden bevægelse under hele optagelsesfasen. Dette passer perfekt til kravene til billeddannelse / overvågning af hjernefysiologi under CA og genoplivning. Denne model er blevet anvendt med succes i eksperimenter, der sigter mod dynamisk at spore cerebral blodgennemstrømning, vaskulære reaktioner og hjernevævsilt i CA-mus, og disse eksperimenter har genereret uvurderlige data om vaskulære ændringer og reaktioner på lægemiddeladministration i CA.