Summary

Внутримозговые инъекции в свободную руку у мышей

Published: January 12, 2024
doi:

Summary

Здесь описан простой и быстрый подход к выполнению внутримозговых инъекций мышам с использованием свободного доступа (то есть без стереотаксического устройства).

Abstract

Исследование нейроэндокринной системы часто требует доставки лекарств, вирусов или других экспериментальных агентов непосредственно в мозг мышей. Внутримозговая инъекция (ИЦВ) позволяет широко распространять экспериментальный агент по всему мозгу (особенно в структурах вблизи желудочков). В данной статье описаны методы проведения инъекций ICV в свободной руке у взрослых мышей. Используя визуальные и тактильные ориентиры на головах мышей, инъекции в боковые желудочки можно делать быстро и надежно. Инъекции делаются стеклянным шприцем, который экспериментатор держит в руке и размещает на приблизительном расстоянии от ориентиров. Таким образом, данная методика не требует стереотаксического кадра. Кроме того, этот метод требует только кратковременной анестезии изофлураном, что позволяет впоследствии оценить поведение и/или физиологию мышей у бодрствующих, свободно ведущих себя мышей. Инъекция ICV в свободную руку является мощным инструментом для эффективной доставки экспериментальных агентов в мозг живых мышей и может сочетаться с другими методами, такими как частый забор крови, манипуляции с нейронными цепями или запись in vivo для исследования нейроэндокринных процессов.

Introduction

Доставка экспериментальных агентов, таких как лекарства1, вирусы2 или клетки3, в мозг часто необходима для нейроэндокринных исследований. Если агент не может легко проникнуть через гематоэнцефалический барьер или цель эксперимента состоит в том, чтобы специально проверить центральные эффекты препарата, важно иметь надежный метод доставки инъекций в мозг. Кроме того, инъекция в внутримозговое (ВЦВ) пространство дает возможность широко распределить агент в головном мозге и обеспечивает большую целевую область, тем самым повышая вероятность успешной инъекции2.

Распространенный метод проведения инъекций ICV включает в себя установку постоянной внутренней канюли. При таком подходе стереотаксическая рама необходима для позиционирования имеющейся в продаже или изготовленной на заказ канюли, так как канюля приклеена или зацементирована на месте. Часто при выздоровлении через канюлю вводят супрафизиологическую дозу ангиотензина II, и если сразу наблюдается питьевое поведение, то канюля считается правильно поставленной4. Такой подход имеет множество преимуществ, в том числе возможность проведения длительной инфузии и возможность многократного введения одному и тому же животному; Кроме того, если используется ангиотензин II, правильное размещение может быть подтверждено до введения экспериментальных соединений. Тем не менее, существуют некоторые ограничения для установки постоянной канюли, в том числе необходимость дорогостоящего оборудования (стереотаксическая рама), возможность повреждения канюли после установки (например, мыши могут жевать канюлю соседа по клетке) и возможность инфекций вокруг постоянной канюли. Однократные инъекции ICV могут быть сделаны с использованием стереотаксического фрейма3, который, хотя и эффективен, требует значительного воздействия анестезии и, таким образом, может скрывать некоторые острые физиологические и поведенческие эффекты лечения. Кроме того, помещение мышей в стереотаксическую рамку требует существенной подготовки для достижения стабильного положения и предотвращения разрыва слуховых проходов.

Здесь описан устоявшийся метод проведения инъекций свободной рукой у мышей. Этот метод основан на предыдущих отчетах 5,6. Преимущества этой методики в том, что она проста, быстра и не требует специализированного оборудования, такого как стереотаксическая рамка. Как описано ниже, эта процедура включает в себя манипуляции со стеклянным шприцем относительно ориентиров на голове мыши для выполнения инъекций, которые могут быть сделаны быстро и, таким образом, требуют всего нескольких минут газовой анестезии в день эксперимента.

Protocol

Все процедуры были одобрены Университетом штата Колорадо (#3960) и Комитетами по институциональному уходу за животными и использованию животных Калифорнийского университета в Сан-Диего, где были собраны репрезентативные данные (S13235, PI Kellie Breen Church). Данные пяти взрослых самок и двух взросл…

Representative Results

При успешном выполнении этот метод позволяет быстро доставить экспериментальный агент в желудочковую систему. На рисунке 2А показан профиль пульса лютеинизирующего гормона (ЛГ) у овариэктомированной мыши, получившей инъекцию ICV в виде 3 мкл стерильного изотонического ?…

Discussion

Здесь описано простое и эффективное средство для проведения инъекций ICV мышам. Поскольку этот метод не требует стереотаксической рамки, такой подход к централизованной доставке лекарств и экспериментальных агентов доступен большему количеству исследователей. Кроме того, этот подход …

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы хотели бы поблагодарить д-ра Келли Брин Черч, г-на Майкла Крайсмана и г-жу Джессику Янг за их вклад в сбор данных, представленных в репрезентативных результатах. Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (NIH) R00 HD104994 (R.B.M.).

Materials

18-gauge blunt needles SAI Infusion B18-150
18-gauge needles BD Medical 305195
Alcohol pads Fisher Scientific 22-363-750
Bench pad Fisher Scientific 14-206-62AC22
Betadine solution Fisher Scientific NC1696484
Buprenorphine Patterson Vet Supply 07-892-5235 Controlled substance
Eyelube Fisher Scientific 50-218-8442
Glass syringe Hamilton 7634-01
Injection needle Hamilton 7803-01 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45
Isoflurane   Patterson Vet Supply 07-893-8441
Isoflurane vaporizer Vet Equip V-10
Laboratory Tape VWR 89098-128
Medical grade oxygen Airgas OX USPEA
Paraformaldehyde Millipore-Sigma 8.18715.1000
Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific J67802.K2
PulsaR Software Open source, University of Otago See ref 9
Ruler Fisher Scientific 12-00-152
Silastic tubing (0.040" I.D.) DOW 508-005
Silastic tubing (0.078" I.D.) DOW 508-009
Sterile saline VWR 101320-574
Sucrose  Fisher Scientific S5-500

Referencias

  1. Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
  2. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
  3. Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).
  4. Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
  5. Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
  6. Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
  7. McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).
  8. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
  9. Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).
  10. Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
  11. Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin’s central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
  12. Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
  13. Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).

Play Video

Citar este artículo
McCosh, R. B., Young, L. A. Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice. J. Vis. Exp. (203), e65324, doi:10.3791/65324 (2024).

View Video