Summary

זריקות תוך-מוחיות ביד חופשית בעכברים

Published: January 12, 2024
doi:

Summary

כאן מתוארת גישה פשוטה ומהירה לביצוע הזרקות תוך-מוחיות בעכברים בגישה של יד חופשית (כלומר, ללא מכשיר סטריאוטקסי).

Abstract

חקירת מערכות נוירואנדוקריניות דורשת לעתים קרובות העברה של תרופות, וירוסים או חומרים ניסיוניים אחרים ישירות למוחם של עכברים. הזרקה תוך-מוחית (ICV) מאפשרת העברה נרחבת של חומר הניסוי ברחבי המוח (במיוחד במבנים הסמוכים לחדרים). כאן מתוארות שיטות לביצוע זריקות ICV ביד חופשית בעכברים בוגרים. על ידי שימוש בציוני דרך חזותיים ומישושיים על ראשי עכברים, זריקות לחדרים הרוחביים יכולות להתבצע במהירות ובאמינות. ההזרקות נעשות באמצעות מזרק זכוכית המוחזק בידו של הנסיין ומונח במרחקים משוערים מציוני הדרך. לפיכך, טכניקה זו אינה דורשת מסגרת סטריאוטקסית. יתר על כן, טכניקה זו דורשת רק הרדמה איזופלורנית קצרה, המאפשרת הערכה עוקבת של התנהגות עכבר ו / או פיזיולוגיה בעכברים ערים המתנהגים בחופשיות. הזרקת ICV ביד חופשית היא כלי רב עוצמה להעברה יעילה של חומרים ניסיוניים למוחם של עכברים חיים, וניתן לשלב אותה עם טכניקות אחרות כגון דגימת דם תכופה, מניפולציה של מעגלים עצביים או הקלטה in vivo כדי לחקור תהליכים נוירואנדוקריניים.

Introduction

אספקת חומרים ניסיוניים, כגון תרופות1, וירוסים2 או תאים3, למוח נחוצה לעתים קרובות למחקר נוירואנדוקריני. אם הסוכן אינו חוצה בקלות את מחסום הדם-מוח או שמטרת הניסוי היא לבדוק באופן ספציפי את ההשפעות המרכזיות של הסוכן, חשוב שתהיה שיטה אמינה להעברת זריקות למוח. יתר על כן, הזרקה לחלל התוך-מוחי (ICV) מספקת הזדמנות להפיץ את החומר באופן נרחב במוח ומספקת אזור מטרה גדול, ובכך מגדילה את הסיכוי להזרקה מוצלחת2.

שיטה נפוצה לביצוע זריקות ICV כוללת מיקום של צינורית מגורים קבועה. בגישה זו, יש צורך במסגרת סטריאוטקסית כדי למקם את הצינורית הזמינה מסחרית או בהתאמה אישית, שכן הצינורית מודבקת או מלטת במקומה. לעתים קרובות, עם ההתאוששות, מינון supraphysiological של אנגיוטנסין II מנוהל דרך הצינורית, ואם התנהגות השתייה נצפתה מיד, אז הצינורית נחשבת ממוקמת כראוי4. לגישה זו יתרונות רבים, ביניהם היכולת לבצע עירוי ארוך טווח והיכולת להזריק לאותו בעל חיים מספר פעמים; בנוסף, אם אנגיוטנסין II מועסק, מיקום נכון ניתן לאשר לפני הממשל של תרכובות ניסיוניות. עם זאת, ישנן כמה מגבלות להצבת צינורית קבועה, כולל הדרישה לציוד יקר (מסגרת סטריאוטקסית), האפשרות לנזק לצינורית לאחר הנחתה (למשל, עכברים יכולים ללעוס צינורית של חבר לכלוב), והאפשרות של זיהומים סביב הצינורית הקבועה. זריקות ICV בודדות יכולות להתבצע באמצעות מסגרת סטריאוטקסית3, אשר, למרות יעילותה, דורשת חשיפה משמעותית להרדמה, ולכן עשויה לטשטש כמה השפעות פיזיולוגיות והתנהגותיות חריפות של הטיפול. בנוסף, מיקום עכברים במסגרת סטריאוטקסית דורש אימון משמעותי להשגת מיקום יציב ומניעת קריעה של תעלות האוזן.

כאן מתוארת שיטה מבוססת לביצוע זריקות ביד חופשית בעכברים. שיטה זו מבוססת על דוחות קודמים 5,6. היתרונות של טכניקה זו הם שהיא פשוטה, מהירה, ואינה דורשת ציוד מיוחד כגון מסגרת סטריאוטקסית. כפי שיתואר להלן, הליך זה כרוך מניפולציה מזרק זכוכית ביחס ציוני דרך על ראש העכבר כדי לבצע את הזריקות, אשר ניתן לעשות במהירות, ולכן, דורש רק כמה דקות של הרדמה גז ביום הניסוי.

Protocol

כל ההליכים אושרו על ידי אוניברסיטת מדינת קולורדו (#3960) ואוניברסיטת קליפורניה סן דייגו מוסדיים טיפול ושימוש בבעלי חיים, שם נאספו הנתונים המייצגים (S13235, PI Kellie Breen Church). נתונים מחמש נקבות בוגרות ושני עכברים זכרים בוגרים C57/BL6 (בני 9-16 שבועות) מתוארים בסעיף הנתונים המייצגים. נקבות עכברות עברו כרית?…

Representative Results

כאשר מבוצעת בהצלחה, טכניקה זו מאפשרת משלוח מהיר של סוכן ניסיוני לתוך מערכת החדרים. פרופיל דופק של הורמון מחלמן (LH) מעכבר שעבר כריתת שחלות שקיבל זריקת ICV של 3 μL של מי מלח איזוטוניים סטריליים, הכלי לתרכובות פרמקולוגיות רבות, מוצג באיור 2A. דוגמה זו מדגימה כי חשיפה קצרה להרדמת גז?…

Discussion

כאן מתואר אמצעי פשוט ויעיל לביצוע זריקות ICV בעכברים. מכיוון שטכניקה זו אינה דורשת מסגרת סטריאוטקסית, גישה זו להעברה מרכזית של תרופות וסוכני ניסוי נגישה לחוקרים נוספים. בנוסף, גישה זו היא תפוקה גבוהה יחסית שכן הליך ההכנה וההזרקה יכול להתבצע במהירות.

מכיוון שהליך זה דורש מניפ?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לד”ר קלי ברין צ’רץ’, למר מייקל קרייסמן ולגב’ ג’סיקה ג’אנג על תרומתם לאיסוף הנתונים המוצגים בתוצאות המייצגות. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) R00 HD104994 (R.B.M).

Materials

18-gauge blunt needles SAI Infusion B18-150
18-gauge needles BD Medical 305195
Alcohol pads Fisher Scientific 22-363-750
Bench pad Fisher Scientific 14-206-62AC22
Betadine solution Fisher Scientific NC1696484
Buprenorphine Patterson Vet Supply 07-892-5235 Controlled substance
Eyelube Fisher Scientific 50-218-8442
Glass syringe Hamilton 7634-01
Injection needle Hamilton 7803-01 27 gauge, Small Hub RN needle, point style: 4, Needle length: 10cm, Angle: 45
Isoflurane   Patterson Vet Supply 07-893-8441
Isoflurane vaporizer Vet Equip V-10
Laboratory Tape VWR 89098-128
Medical grade oxygen Airgas OX USPEA
Paraformaldehyde Millipore-Sigma 8.18715.1000
Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific J67802.K2
PulsaR Software Open source, University of Otago See ref 9
Ruler Fisher Scientific 12-00-152
Silastic tubing (0.040" I.D.) DOW 508-005
Silastic tubing (0.078" I.D.) DOW 508-009
Sterile saline VWR 101320-574
Sucrose  Fisher Scientific S5-500

Referencias

  1. Roseweir, A. K., et al. Discovery of potent kisspeptin antagonists delineate physiological mechanisms of gonadotropin regulation. Journal of Neuroscience. 29 (12), 3920-3929 (2009).
  2. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
  3. Taylor, Z. V., Khand, B., Porgador, A., Monsonego, A., Eremenko, E. An optimized intracerebroventricular injection of CD4(+) T cells into mice. STAR Protocols. 2 (3), 100725 (2021).
  4. Russo, K. A., et al. Circadian control of the female reproductive axis through gated responsiveness of the RFRP-3 system to VIP signaling. Endocrinology. 156 (7), 2608-2618 (2015).
  5. Laursen, S. E., Belknap, J. K. Intracerebroventricular injections in mice. Some methodological refinements. Journal of Pharmacological Methods. 16 (4), 355-357 (1986).
  6. Haley, T. J., McCormick, W. G. Pharmacological effects produced by intracerebral injection of drugs in the conscious mouse. British Journal of Pharmacology and Chemotherapy. 12 (1), 12-15 (1957).
  7. McCosh, R. B., et al. Insulin-induced hypoglycaemia suppresses pulsatile luteinising hormone secretion and arcuate Kiss1 cell activation in female mice. Journal of Neuroendocrinology. 31 (12), e12813 (2019).
  8. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988 (2021).
  9. Comba, A., et al. Laser capture microdissection of glioma subregions for spatial and molecular characterization of intratumoral heterogeneity, oncostreams, and invasion. Journal of Visual Experiments. (158), e60939 (2020).
  10. Porteous, R., et al. Reformulation of PULSAR for analysis of pulsatile LH secretion and a revised model of estrogen-negative feedback in mice. Endocrinology. 162 (11), (2021).
  11. Hohmann, J. G., et al. Differential role of melanocortins in mediating leptin’s central effects on feeding and reproduction. American Journal of Physiology: Regulatory, Integrative, and Comparative Physiology. 278 (1), R50-R59 (2000).
  12. Gottsch, M. L., et al. A role for kisspeptins in the regulation of gonadotropin secretion in the mouse. Endocrinology. 145 (9), 4073-4077 (2004).
  13. Krasnow, S. M., et al. A role for galanin-like peptide in the integration of feeding, body weight regulation, and reproduction in the mouse. Endocrinology. 144 (3), 813-822 (2003).

Play Video

Citar este artículo
McCosh, R. B., Young, L. A. Free-Hand Intracerebroventricular Injections in Mice. J. Vis. Exp. (203), e65324, doi:10.3791/65324 (2024).

View Video