Summary

Una tecnica migliorata per il rilevamento della trimetilammina nella medicina di derivazione animale mediante gascromatografia dello spazio di testa-spettrometria di massa a quadrupolo tandem

Published: March 10, 2023
doi:

Summary

Qui viene descritto un metodo di spettrometria di massa a quadrupolo tandem (HS-GC-MS/MS) dello spazio di testa adatto per la determinazione della trimetilammina (TMA) in medicinali di derivazione animale. Il protocollo include il pretrattamento del campione, il trattamento dello spazio di testa, le condizioni di analisi, la convalida metodologica e la determinazione della TMA nei medicinali di derivazione animale.

Abstract

I farmaci di origine animale hanno caratteristiche distintive e significativi effetti curativi, ma la maggior parte di essi ha un evidente odore di pesce, con conseguente scarsa conformità dei pazienti clinici. La trimetilammina (TMA) è uno dei componenti chiave dell’odore di pesce nella medicina di derivazione animale. È difficile identificare con precisione la TMA utilizzando il metodo di rilevamento esistente a causa dell’aumento della pressione nella fiala dello spazio di testa causato dalla rapida reazione acido-base dopo l’aggiunta di liscivia, che causa la fuoriuscita di TMA dalla fiala dello spazio di testa, bloccando il progresso della ricerca sull’odore di pesce della medicina di derivazione animale. In questo studio, abbiamo proposto un metodo di rilevamento controllato che ha introdotto uno strato di paraffina come strato di isolamento tra acido e liscivia. La velocità di produzione di TMA potrebbe essere efficacemente controllata liquefacendo lentamente lo strato di paraffina attraverso il riscaldamento termostatico del forno. Questo metodo ha mostrato linearità soddisfacente, esperimenti di precisione e recuperi con buona riproducibilità e alta sensibilità. Ha fornito supporto tecnico per la deodorizzazione della medicina di derivazione animale.

Introduction

Il trattamento delle malattie umane utilizzando prodotti derivati da parti animali e / o loro sottoprodotti (indicati qui come medicinali di derivazione animale) sta ricevendo maggiore attenzione. Svolgono un ruolo importante nel trattamento del cancro, delle malattie cardiovascolari, della cirrosi epatica, della mastite e di altre malattie, con i vantaggi di un forte effetto, piccoli dosaggi e un’efficacia clinica significativa e specifica. Tuttavia, i farmaci di origine animale hanno generalmente un odore di pesce prominente, che influisce notevolmente sulla compliance dei pazienti e sono particolarmente sfavorevoli per i bambini 1,2. L’odore di pesce proviene principalmente dalle proteine, dagli amminoacidi, dai grassi e da altre sostanze contenute nel medicinale, che vengono decomposti attraverso l’ossidazione degli acidi grassi, la degradazione degli amminoacidi e altri modi per produrre una varietà di sostanze con un odore di pesce 2,3,4. Tra questi, la trimetilammina (TMA) è un gas volatile con un odore di pesce che esiste ampiamente negli alimenti di origine animale marci o marci5.

Fino ad ora, la gascromatografia (GC), la cromatografia liquida (LC), la cromatografia ionica, la spettrofotometria, la cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) e i metodi dei sensori sono stati comunemente utilizzati per rilevare TMA nell’ambiente, negli alimenti e nelle urine 6,7,8,9. In considerazione della bassa contaminazione della colonna GC e del sistema di iniezione, nonché dell’elevata sensibilità, riproducibilità e basso limite di rivelazione (0,1-1 mg/kg), è stato preferito il metodo della gascromatografia-spettrometria di massa dello spazio di testa (HS-GC-MS) per l’analisi alimentare e biologica8. Al momento, solo la Cina ha stabilito uno standard nazionale per TMA negli alimenti e HS-GC-MS è il primo metodo nello standard GB5009.179-201610. Pertanto, il suddetto metodo HS-GC-MS è stato selezionato per rilevare la TMA nella medicina di derivazione animale. Nella fase iniziale, il nostro gruppo di ricerca ha scoperto che lo standard di rilevamento HS-GC-MS per TMA negli alimenti potrebbe rilevare l’odore di pesce in diversi farmaci di origine animale. In combinazione con i risultati degli studi11,12, è stato possibile dimostrare che la TMA è la sostanza chiave comune dell’odore di pesce nei medicinali di derivazione animale. Tuttavia, si è riscontrato che la riproducibilità dei risultati sperimentali era scarsa e c’erano problemi come la fuga di TMA e la scarsa stabilità, che non potevano essere verificati dalla metodologia. Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che la liscivia è stata iniettata nella fiala dello spazio di testa e la rapida reazione acido-base ha portato ad un aumento della pressione nel flaconcino, quindi TMA è fuoriuscito dal poro di iniezione, impedendo il rilevamento stabile e accurato di TMA. Pertanto, questo studio ha proposto un metodo di rilevamento migliorato per la spettrometria di massa quadrupolare tandem dello spazio di testa (HS-GC-MS / MS) per affrontare questi problemi.

Il protocollo migliora il pretrattamento del campione separando i reagenti acido-base nel pretrattamento con l’aiuto di paraffina solida, un buon materiale a cambiamento di fase solido-liquido. Mentre la paraffina si liquefaceva lentamente con l’aumento della temperatura del forno termostatico, anche il TMA veniva rilasciato lentamente nella fiala sigillata dello spazio di testa, evitando l’aumento di pressione causato dalla violenta e rapida reazione acido-base e garantendo un rilevamento stabile e accurato del TMA. Inoltre, l’iniezione dello spazio di testa combinata con le modalità di monitoraggio delle reazioni multiple (MRM) in GC-MS / MS ha efficacemente soppresso l’interferenza chimica della matrice e ha garantito l’affidabilità dei risultati. I risultati della convalida metodologica hanno dimostrato che la linearità, il test di precisione e il tasso di recupero del metodo di rilevamento migliorato potevano soddisfare i requisiti, con una buona riproducibilità e un’elevata sensibilità.

Protocol

Vedere la Tabella 1 per informazioni sui medicinali di Pheretima, Periplaneta americana e Hirudo. Sono stati identificati dal Prof. Xu Runchun, dell’Università di Medicina Tradizionale Cinese di Chengdu, come i corpi essiccati di Pheretima aspergillum (E.Perrier), Periplaneta americana L. e Whitmania pigra Whitman. 1. Estrazione del campione Schiacciare Pheretima, Periplaneta america…

Representative Results

I diagrammi schematici del principio di pre-elaborazione e del funzionamento di questo protocollo sono mostrati rispettivamente nella Figura 1 e nella Figura 2. Il tempo di picco della TMA è stato di 2,3 minuti, con una forma a picco nitida e nessuna interferenza da altre impurità (Figura 3). Misurando l’intervallo lineare della soluzione standard TMA 0,1-10 μg/mL, con concentrazione TMA come ascissa e area di picco come ordinata…

Discussion

I medicinali di origine animale provengono da tutto il corpo, organi o tessuti, prodotti fisiologici o patologici, escrezioni o secrezioni e prodotti trasformati di animali. La TMA è un’importante fonte di odore di pesce nei medicinali di derivazione animale; è una tipica sostanza maleodorante con una soglia olfattiva molto bassa (0,000032 × 10-6 V/V) e un forte odore di pesce13. Allo stato attuale, il metodo HS-GC-MS comunemente usato non è in grado di rilevare la TMA nei medicinal…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (82173991) e del Sichuan Science and Technology Program (2022YFS0442).

Materials

Centrifuge Beckman Coulter Trading (China) Co. SSC-2-0213
Chinese herbal medicine grinder Zhejiang Yongkang Xi'an Hardware and Pharmaceutical Factory HX-200K
Convection oven Sanyo Electric Co., Ltd MOV-112F
Decapper for 20 mm Aluminum caps ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc V1750004
Electronic balance Shimadzu Corporation Japan AUW220D
Gas chromatography mass spectrometry Shimadzu Corporation Japan TQ-8050 NX
Headspace Vial ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc 25760200
Homogenizer Shanghai biaomo Factory FJ200-SH
Preassembled Cap ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc L4150050
Sample sieve Zhenxing Sieve Factory /
SH-Volatile Amine Chengdu Meimelte Technology Co., Ltd 227-3626-01
Sodium hydroxide Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd 2022101401
Solid paraffin wax Shanghai Hualing Kangfu apparatus factory 20221112
Trichloroacetic acid Chengdu Chron Chemicals Co., Ltd 2022102001
Trimethylamine hydrochloride Chengdu Aifa Biotechnology Co., Ltd AF22022108
Ultra-pure water system Sichuan Youpu Ultrapure Technology Co., Ltd UPR-11-5T

Referencias

  1. Fan, H., et al. Material basis of stench of animal medicine: a review. China Journal of Chinese Materia Medica. 47 (20), 5452-5459 (2022).
  2. Deng, Y. J., et al. Progress on formation and taste-masking technology of stench of animal medicines. China Journal of Chinese Materia Medica. 45 (10), 2353-2359 (2020).
  3. Casaburi, A., Piombino, P., Nychas, G. J., Villani, F., Ercolini, D. Bacterial populations and the volatilome associated to meat spoilage. Food Microbiology. 45 (Pt A), 83-102 (2015).
  4. Rouger, A., Tresse, O., Zagorec, M. Bacterial contaminants of poultry meat: sources, species, and dynamics. Microorganisms. 5 (3), 50 (2017).
  5. Baliño-Zuazo, L., Barranco, A. A novel liquid chromatography-mass spectrometric method for the simultaneous determination of trimethylamine, dimethylamine and methylamine in fishery products. Food Chemistry. 196, 1207-1214 (2016).
  6. Zhao, C., et al. Ultra-efficient trimethylamine gas sensor based on Au nanoparticles sensitized WO3 nanosheets for rapid assessment of seafood freshness. Food Chemistry. 392, 133318 (2022).
  7. Bota, G. M., Harrington, P. B. Direct detection of trimethylamine in meat food products using ion mobility spectrometry. Talanta. 68 (3), 629-635 (2006).
  8. Neyer, P., Bernasconi, L., Fuchs, J. A., Allenspach, M. D., Steuer, C. Derivatization-free determination of short-chain volatile amines in human plasma and urine by headspace gas chromatography-mass spectrometry. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 34 (2), e23062 (2020).
  9. Mitsubayashi, K., et al. Trimethylamine biosensor with flavin-containing monooxygenase type 3 (FMO3) for fish-freshness analysis. Sensors & Actuators B: Chemical. 103 (1-2), 463-467 (2004).
  10. National Health and Family Planning Commission of the People’s Republic of China. . GB 5009. 179-2016. , 12 (2016).
  11. Liu, X. M., et al. Study on material basis and processing principle of fishy smell of Pheretima aspergillum by electronic nose and HS-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 26 (12), 154-161 (2020).
  12. Zheng, X., Sun, F., Du, L., Huang, Y., Zhang, Z. Comparison on changes of volatile components in Gecko before and after processing by HS-SPME-GC-MS. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae. 28 (15), 145-152 (2022).
  13. Yoshiharu, I. . Odor olfactory measurement. , (2004).
  14. Jia, Z. W., Mao, B. P., Miao, S., Mao, X. H., Ji, S. Determination of sulfur dioxide residues in sulfur fumigated Chinese herbs with headspace gas chromatography. Acta Pharmaceutica Sinica. 49 (2), 277-281 (2014).

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Citar este artículo
Ye, H., Liu, X., Liao, J., Huang, H., Huang, L., Bao, Y., Ma, H., Lin, J., Bao, X., Zhang, D., Xu, R. An Improved Technique for Trimethylamine Detection in Animal-Derived Medicine by Headspace Gas Chromatography-Tandem Quadrupole Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (193), e65291, doi:10.3791/65291 (2023).

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