Summary

שימוש בפינצטה אופטית כפולה ומיקרופלואידיקה למחקרי מולקולות בודדות

Published: November 18, 2022
doi:

Summary

ביוכימיה חזותית של מולקולה בודדת הנחקרת באמצעות תאים מיקרופלואידיים מקלה מאוד באמצעות קנה זכוכית, מזרקים אטומים לגז, חיבורים יציבים של צינורות לתאי זרימה, וחיסול בועות על ידי הצבת שסתומי מיתוג בין המזרקים והצינורות. הפרוטוקול מתאר מלכודות אופטיות כפולות המאפשרות הדמיה של עסקאות דנ”א ואינטראקציות בין-מולקולריות.

Abstract

ביוכימיה חזותית היא טכניקה רבת עוצמה להתבוננות בתכונות הסטוכסטיות של אנזימים בודדים או קומפלקסים של אנזימים המוסתרים בממוצע המתרחש במחקרים בתפזורת. כדי להשיג הדמיה, פינצטות אופטיות כפולות, שבהן מלכודת אחת קבועה והשנייה ניידת, ממוקדות בערוץ אחד של תא מיקרופלואידי מרובה זרמים הממוקם על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך. הפינצטה האופטית לוכדת מולקולות בודדות של דנ”א מסומן פלואורסצנטי וזרימת נוזלים דרך החדר ומעבר לחרוזים הלכודים, מותחת את הדנ”א לצורת B (תחת כוח מינימלי, כלומר 0 pN) כאשר חומצת הגרעין נצפית כחוט לבן על רקע שחור. מולקולות דנ”א מועברות מזרם אחד למשנהו, על ידי תרגום השלב הניצב לזרימה כדי לאפשר ייזום תגובות באופן מבוקר. כדי להשיג הצלחה, התקנים microfluidic עם ערוצים ברורים אופטית מחוברים מזרקי זכוכית מוחזקים במקום משאבת מזרק. תוצאות אופטימליות משתמשות במחברים המחוברים באופן קבוע לתא הזרימה, צינורות קשיחים מכנית ועמידים כימית, ואשר מחוברים לשסתומי מיתוג המסלקים בועות האוסרות על זרימה למינרית.

Introduction

היכולת לדמיין אינטראקציות חלבון-דנ”א ברמת המולקולה הבודדת ובזמן אמת סיפקה תובנה משמעותית לגבי יציבות הגנום 1,2. בנוסף לעבודה עם מולקולות בודדות של דנ”א בזו אחר זו, היכולת להציג עסקאות בין מולקולות בודדות בקרבת מקום מספקת תובנה נוספת 3,4,5. המניפולציה של מולקולות דנ”א נוספות דורשת הן מלכודות אופטיות נוספות והן תאי זרימה מיקרופלואידית איכותיים, רב-ערוציים,6.

קיימות מספר שיטות ליצירת יותר ממלכודת אופטית אחת. אלה כוללים מראות סריקת גלוונומטר, מודולטורים אופטיים אקוסטיים ואופטיקה דיפרקטיבית, המייצרים פינצטה אופטית הולוגרפית 4,7,8,9. לעתים קרובות, מראות סורקות ומודולטורים אופטיים אקוסטיים מייצרים מלכודות המשותפות בזמן. במערך המתואר כאן, הקרן של לייזר Nd:YAG יחיד מפוצלת על קיטוב, ואז מראות סריקת לייזר גלוונומטר שולטות במיקום של מה שמכונה מלכודת ניידת (איור 1)4. כדי להקל על מיקום המראות והמסננים כדי לכוון את קרן הלכידה למפתח הצמצם האחורי של מטרת המיקרוסקופ, נעשה שימוש בלייזר HeNe. זה הופך את היישור הכללי לקל יותר מכיוון שקרן HeNe נראית לעין בלתי, בעוד שקרני אינפרא אדום אינן. קרן HeNe גם בטוחה יותר לעבודה עם הפיכת המיקום של מראות ורכיבים אחרים לפחות מלחיץ. בתחילה, נתיב הקרן עבור לייזר זה נפרד מן הקרן 1064 ננומטר, אבל הוא הציג לתוך אותו נתיב קרן, ולאחר מכן לתוך מטרת המיקרוסקופ. לאחר השגת יישור פיזי, נעשה מיקום קרן 1064 ננומטר על גבי קרן HeNe וזה מתאפשר על ידי שימוש בצופה אינפרא אדום ובכלי הדמיית קרן שונים כדי לדמיין את מיקום הקרן ואיכותה. לאחר מכן, מרחיב הקרן מוצג, וקרן האינפרא אדום המורחבת המתקבלת מיושרת על הפתח האחורי של המטרה. לבסוף, המטרה מוסרת והעוצמה בכל קרן מקוטבת נמדדת ומותאמת באמצעות לוחות גל λ/2 כדי להיות שווים (איור 1C). מדידות הספק נעשות גם לאחר החזרת המטרה ובדרך כלל יש אובדן הספק של 53%. עם זאת, יש מספיק כוח כדי ליצור מלכודות אופטיות קבועות ונעות יציבות במישור המוקד (איור 1D).

כדי לדמות עסקאות דנ”א, תאי זרימה מיקרופלואידיים ממלאים תפקיד מפתח כשהם מאפשרים מדידות מבוקרות ברמת המולקולה הבודדת עם רזולוציה מרחבית וזמנית גבוהה (איור 2). המונח microfluidic מתייחס ליכולת לתפעל נוזלים בערוץ אחד או יותר עם ממדים הנעים בין 5-500 מיקרומטר10,11. המונח זרם מתייחס לנוזל בפועל בתוך ערוץ והערוץ מתייחס לערוץ הפיזי שבו זרם זורם או זרמים נעים. לתכנון תא זרימה חד-ערוצי יש ערוץ פיזיקלי משותף שבו נצפות תגובות, ובדרך כלל קיים רק זרם נוזל אחד. לפיכך, עיצובים אלה ידועים כתאי זרימה חד-זרמיים. לעומת זאת, תאי זרימה מרובי זרמים מוגדרים כמכשיר מיקרופלואידי שבו שני ערוצי כניסה או יותר מתכנסים לערוץ פיזיקלי יחיד ומשותף (איור 2A). בתוך הערוץ המשותף, הזרמים הזורמים שמקורם בערוצים הבודדים זורמים במקביל זה לזה, ונותרים מופרדים כאשר הערבוב המינימלי ביניהם מתרחש רק כתוצאה מדיפוזיה (איור 2B). ברוב המערכות הניסיוניות, משאבה אחת דוחפת נוזלים לכל ערוץ באותה מהירות. לעומת זאת, כאשר נעשה שימוש בהיגוי גבול, שלוש משאבות או יותר, הנשלטות באופן עצמאי, דוחפות נוזלים דרך התעלות. עם זאת, כל משאבה פועלת במהירות שונה אך קצב הזרימה נטו בערוץ המשותף הואקבוע 12. זה מאפשר החלפה מהירה של רכיבי הערוץ הראשי פשוט על ידי שינוי מהירות המשאבה.

בנוסף לזרימה הלמינרית, גורם קריטי נוסף הוא פרופיל המהירות הפרבולית בתוך זרם הנוזל הלמינרי. מהירות הזרימה הגבוהה ביותר מתרחשת באמצע הנחל, והאיטית ביותר מתרחשת ליד המשטחים (איור 2C)13. יש לשקול פרופיל זה כדי למתוח באופן מלא מולקולת דנ”א המחוברת לחרוז המוחזק בזרם לצורך הדמיה מדויקת של דנ”א פלואורסצנטי וניתוחים מדויקים של מולקולה בודדת. כאן, הדנ”א נמתח לצורת B ומוחזק במקומו תחת 0 pN של כוח. כדי להשיג זאת, המיקוד של מיקום ההשמנה האופטית צריך להיות במיקום של 10-20 מיקרומטר ממשטח הכיסוי התחתון (איור 2D). יש להקפיד על כך שמולקולת הדנ”א לא תימתח מעבר לצורת B, שכן הדבר עלול לעכב תגובות אנזימיות. בתנאי חיץ טיפוסיים, 1 מיקרומטר = 3,000 bp של DNA14. יתר על כן, על ידי לכידת 10-20 מיקרומטר מהכיסוי, קומפלקס הדנ”א ממוקם הרחק מפני השטח ובכך ממזער את האינטראקציות על פני השטח.

שיטות רבות שימשו ליצירת ערוצי התקנים מיקרופלואידיים וניתן לעשות זאת במעבדה או לרכוש תאי זרימה ממקורות מסחריים 6,15,16,17. החומרים האופטימליים המשמשים לבניית תאי הזרימה חייבים להיות קשיחים מכנית, שקופים אופטית עם פלואורסצנטיות נמוכה, ואטומים לממיסים אורגניים6. לעתים קרובות, זכוכית צפה בורוסיליקט, או סיליקה מתמזגת משמשים כדי לספק סביבת זרימה יציבה לזמן ממושך המתאימה להשמנה אופטית, הדמיה וזיהוי כוח. חומרים אלה מאפשרים גם שימוש בממיסים לא מימיים (למשל, מתנול בדרגה ספקטרופוטומטרית) כדי לפשט את ההרטבה וההסרה של בועות אוויר, ודנטורנטים (למשל, 6M guanidinium hydrochloride) או דטרגנטים לניקוי תא הזרימה. לבסוף, השיטות המשמשות להחדרת נוזלים לתאי זרימה משתנות ממערכות משאבות ואקום מורכבות למשאבות מזרק יחיד 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. בגישה המתוארת כאן, נעשה שימוש במשאבת מזרק שיכולה להכיל עד 10 מזרקים (איור 3A). הדבר מספק גמישות לשימוש בתאי זרימה חד-ערוציים או בתאי זרימה עם ערוצי כניסה מרובים. כאן נעשה שימוש בתא זרימה בעל שלושה ערוצים, והוא מחובר למזרקים המוחזקים במקומם על משאבת המזרק באמצעות צינורות פולי-אתר-אתר-קטון (PEEK) (איור 3A-C). זרימת הנוזלים נשלטת על-ידי שסתומי מיתוג בעלי ארבעה כיוונים, ולכן היא משמשת למזעור החדרת בועות לתא הזרימה (איור 3A,D). בנוסף, מזרקי המילטון בעלי דפנות זכוכית נוקשות ובוכנות מצופות פוליטטרה-פלואורואתילן (PTFE), מומלצים מכיוון שהם מספקים תנועת בוכנה חלקה במיוחד החיונית להשגת זרימה חלקה14,27.

במערכת הניסוי המתוארת נעשה שימוש בתאי זרימה עם שניים עד חמישה ערוצי כניסה. מספר ערוצי הכניסה מוכתב על ידי הניסוי שנעשה. לצורך המחקר של RecBCD ו- Hop2-Mnd1, שני ערוצי זרם היומספיקים 14,28. עבור ההליקאז, האנזים נקשר לקצה החופשי של הדנ”א ותורגם לזרם המכיל מגנזיום ו-ATP כדי ליזום טרנסלוקציה ושחרור. עבור Hop2-Mnd1, דנ”א לכוד אופטית תורגם לזרם הנוזלים הסמוך המכיל חלבונים וחיץ ± יוני מתכת דיוולנטיים. השימוש בתאי זרימה תלת-ערוציים מאפשר ללכוד דנ”א בזרם 1, לתרגם את הדנ”א לזרם 2 כדי לאפשר קשירת חלבונים, ולאחר מכן להזרים 3 היכן ש-ATP נמצא, למשל, כדי ליזום תגובות. וריאציה על האמור לעיל היא להשתמש בחלבון מתויג פלואורסצנטי בערוץ 2, מה שגורם לזרם הנוזלים להיות לבן לחלוטין ומונע הדמיה של הדנ”א. כאשר מולקולה זו מתורגמת לזרם 3, גם חלבונים וגם דנ”א נראים כעת כאשר מתחילות תגובות.

השימוש בשסתומי מיתוג בעלי ארבעה כיוונים לשליטה בזרימת הנוזלים הוא מרכיב קריטי במערכת לסילוק בועות בתאי הזרימה. בועות מזיקות לזרימת נוזלים יציבה כאשר הן מתכווצות ומתרחבות בדרכים בלתי צפויות וכתוצאה מכך שינויים מהירים במהירות הזרימה והכנסת מערבולות. כאשר השסתומים ממוקמים בין מזרקים וצינורות כניסה, נתיב הזרימה מנותק על ידי החלפת מיקום השסתום כאשר מזרקים מוחלפים. כאשר מזרק חדש הוא הניח במקום, הבוכנה יכולה להיות מדוכאת באופן ידני כך >6 μL נפלט (נפח מת של השסתום) וזה מבטל בועות כמעט לחלוטין.

החיבור של מחברים לתאי זרימה הוא לעתים קרובות השלב המגביל את הקצב בשימוש בתאי זרימה. אנו מתארים את השימוש בשני סוגים של מחברים: נשלפים המכונים התאמה לעיתונות וקבועים (מכללי ננו-פורט). המחברים הנשלפים פשוטים להיצמד לתא זרימה וניתן לבדוק סוגים שונים של צינורות גמישים בנוסף ל- PTFE המומלץ עם מחברים אלה. זוהי דרך מהירה וחסכונית לבדוק צינורות ומחברים מבלי להקריב תאי זרימת זכוכית יקרים יותר. לעומת זאת, מכלולי ננו-פורט מחוברים באופן קבוע, עומדים בלחצים של עד 1,000 psi, ובידינו השימוש בהם מוגבל לצינורות PEEK בקטרים שונים. זה לא חיסרון שכן עדיף להשתמש בצינורות PEEK. תא זרימת זכוכית יחיד עם מכלולים קבועים מחוברים ניתן לעשות שימוש חוזר במשך יותר משנה עם שימוש זהיר.

Protocol

1. יישור מלכודת לייזר ובדיקה עם חרוזי פוליסטירן הערה: עבור ההתקנה, עיין באיור 1A,B. התראה: על הנסיין להרכיב משקפי מגן מתאימים או משקפי בטיחות לייזר במהלך יישור קרן לייזר. מכיוון שמערכת הפינצטה האופטית המתוארת כאן משתמשת הן באלומ…

Representative Results

הבדיקה הראשונית של יישור וחוזק המלכודת נעשית עם 1 μm, חרוזי פוליסטירן שאינם פלואורסצנטיים. מאחר שרוב המחקר שנעשה במעבדה משתמש בפלואורסצנציה, אנו בודקים עוד יותר את חוזק המלכודת באמצעות 1 מיקרומטר, חרוזי פוליסטירן ירוק דרקון (איור 1D,E). לאחר מכן העבודה משתנה להשמנה א?…

Discussion

הרכבה זהירה של מערכת הזרימה היא קריטית לתוצאה המוצלחת של ניסויים 4,6. אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של הפרוטוקול הוא חיבור המחברים למשטח הזכוכית. לשם כך, אנו משתמשים בשתי הגישות הבאות: מחברי צינורות בהתאמה לעיתונות ומכללי ננו-יציאות. מחברים המתאימים ללחיצה נצמ?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחקר במעבדת ביאנקו נתמך על ידי מענקי NIH GM100156 ו- GM144414 ל- P.R.B.

Materials

100x objective Leica 506318 or 506038 Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging
10X Objective Leica 506263 Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell
1 mm fluorescent beads Bangs Labs FSDG004 Used for tap performance, focal position determination
1 mm polystyrene beads Bangs Labs CPO1004 Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules
63x objective Leica 506081 Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens
Alignment laser Lumentum 1100 series 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics
Beam alignment camera Amscope MU303 A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position
Camera control and Image capture software Hamamatsu HCImage Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching
Camera; Orca flash 4 Hamamatsu c13440-20cu CCD camera for imaging of single-molecule experiments
C-mount for the beam alignment camera Spot imaging solutions DE50CMT Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment
C-mount for the Orca Flash 4 camera Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.
Cy5  fluorescence filter cube Semrock cy5-404a-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only
Fitc-Txred  fluorescence filter cube Semrock fitc/txred-2x-b-000 Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed
Fluidics tubing Grace Bio 46004 PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used
GFP fluorescence filter cube Semrock gfp-3035b-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only
Glass flow cells Translume Custom Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)
Glass glue Loctite 233841 Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells
Glass/PDMS sandwich flow cells CIDRA Precision services Custom design Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)
Hamilton Cleaning solution Hamilton 18311 Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully
Illumination system Sutter Instrument Lamda DG4 Discontinued so recommend Lambda 721
Illumination system Sutter Instrument Lamda DG4 Discontinued so recommend Lambda 721
Image analysis software Media cybernetics Image Pro Premiere Analysis of images and single molecule tracking
Image analysis software Fiji/NIH Image/Image J Shareware Analysis of images and single molecule tracking
Image display card Melles Griot 06 DLA 001 Alternate product from Thorlabs: VRC5
Immersion oil Zeiss 444960 Immersol 518 F fluorescence free
Laser beam alignment tools Thor labs FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1  Used to ensure beams are horizontal and at the correct height
Laser beam viewer Canadian Photonics labs IR 3150 Used to image IR beam spots on mirrors and  targets
Laser power meter Thor labs Measurement of laser output as well as trap strength
Laser safety glasses (HeNe) Thor labs LG7 or 8 Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm
Laser safety glasses (IR) Thor labs LG11 Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm
Mcherry  fluorescence filter cube Semrock mcherry-a-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only
Microscope Leica DMIRE2 DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror
Microscope control software  UCSF/shareware uManager Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control
Nanoport assembly IDEX N333 Connectors that are bonded to flow cells
Optical table support Thor Labs PA52502 Active isolation table support
Optics and lenses Solar TII Various Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system
PDMS flow cells ufluidix Custom Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)
PEEK tubing IDEX 1532 Provides excellent connection to flow cells and switching valves
Pinkel fluorescence filter cube Semrock lf488/543/635-3x-a-000 Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly
Press fit tubing connectors GraceBio 46003 Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass
Scanning mirrors GSI Lumonics VM500 Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific
Stage Leica
Stage micrometer Electron Microscopy Sciences 68042-08 Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration
Switching valves IDEX V-101T Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells
Syringe and valve manifold Machine shop None Custom built
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000 Controls fluid flow through flow cells
Syringe pump software Harvard Apparatus 70-6000 Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow
Syringes Hamilton 81320 Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers
Table top Thor Labs T36H Optical table top or breadboard
Trapping laser Newport/Spectra Physics J-series; BL106C Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser

Referencias

  1. Bianco, P. R., Lu, Y. Single-molecule insight into stalled replication fork rescue in Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4220-4238 (2021).
  2. Kaur, G., Lewis, J. S., van Oijen, A. M. Shining a spotlight on DNA: Single-molecule methods to visualise DNA. Molecules. 24 (3), 491 (2019).
  3. Dame, R. T., Noom, M. C., Wuite, G. J. Bacterial chromatin organization by H-NS protein unravelled using dual DNA manipulation. Nature. 444 (7117), 387-390 (2006).
  4. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  5. Amitani, I., Liu, B., Dombrowski, C. C., Baskin, R. J., Kowalczykowski, S. C. Watching individual proteins acting on single molecules of DNA. Methods in Enzymology. 472, 261-291 (2010).
  6. Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).
  7. Visscher, K., Brakenhoff, G. J., Krol, J. J. Micromanipulation by multiple optical traps created by a single fast scanning trap integrated with the bilateral Confocal scanning laser microscope. Cytometry. 14, 105-114 (1993).
  8. Vermeulen, K. C., Mameren, J. v. Calibrating bead displacements in optical tweezers using acousto-optic deflectors. Review of Scientific Instruments. 77 (1), 013704 (2006).
  9. Dufresne, E. R. Computer-generated holographic optical tweezers arrays. Review of Scientific Instruments. 72 (3), 1810 (2001).
  10. Squires, T. M., Quake, S. R. Microfluidics: fluid physics at the nanoliter scale. Reviews of Modern Physics. 77, 977-1026 (2005).
  11. Weibel, D. B., Whitesides, G. M. Applications of microfluidics in chemical biology. Current Opinion in Chemical Biology. 10 (6), 584-591 (2006).
  12. Tan, X., Mizuuchi, M., Mizuuchi, K. DNA transposition target immunity and the determinants of the MuB distribution patterns on DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13925-13929 (2007).
  13. Lima, R., Wada, S., Takeda, M., Tsubota, K., Yamaguchi, T. In vitro confocal micro-PIV measurements of blood flow in a square microchannel: the effect of the haematocrit on instantaneous velocity profiles. Journal of Biomechanics. 40 (12), 2752-2757 (2007).
  14. Bianco, P. R., et al. Processive translocation and DNA unwinding by individual RecBCD enzyme molecules. Nature. 409 (6818), 374-378 (2001).
  15. Forget, A. L., Dombrowski, C. C., Amitani, I., Kowalczykowski, S. C. Exploring protein-DNA interactions in 3D using in situ construction, manipulation and visualization of individual DNA dumbbells with optical traps, microfluidics and fluorescence microscopy. Nature Protocol. 8 (3), 525-538 (2013).
  16. Streets, A. M., Huang, Y. Microfluidics for biological measurements with single-molecule resolution. Current Opinion in Biotechnology. 25, 69-77 (2014).
  17. Madariaga-Marcos, J., Corti, R., Hormeno, S., Moreno-Herrero, F. Characterizing microfluidic approaches for a fast and efficient reagent exchange in single-molecule studies. Scientific Reports. 10 (1), 18069 (2020).
  18. Grayson, P., Han, L., Winther, T., Phillips, R. Real-time observations of single bacteriophage lambda DNA ejections in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (37), 14652-14657 (2007).
  19. Luo, G., Wang, M., Konigsberg, W. H., Xie, X. S. Single-molecule and ensemble fluorescence assays for a functionally important conformational change in T7 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (31), 12610-12615 (2007).
  20. Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24 (21), 3563-3576 (2003).
  21. Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79 (2), 1155-1167 (2000).
  22. Kim, S., Blainey, P. C., Schroeder, C. M., Xie, X. S. Multiplexed single-molecule assay for enzymatic activity on flow-stretched DNA. Nature Methods. 4 (5), 397-399 (2007).
  23. Tanaka, H., Ishijima, A., Honda, M., Saito, K., Yanagida, T. Orientation dependence of displacements by a single one-headed myosin relative to the actin filament. Biophysical Journal. 75 (4), 1886-1894 (1998).
  24. Merenda, F., Andrews, D. L., Galves, E. J., Nienhuis, G., et al. Refractive multiple optical tweezers for parallel biochemical analysis in micro-fluidics. Proceeding of SPIE. , 6483 (2007).
  25. Brewer, L. R., Corzett, M., Balhorn, R. Protamine-induced condensation and decondensation of the same DNA molecule. Science. 286 (5437), 120-123 (1999).
  26. Ladoux, B., Quivy, J. P., Doyle, P. S., Almouzni, G., Viovy, J. L. Direct imaging of single-molecules: from dynamics of a single DNA chain to the study of complex DNA-protein interactions. Science Progress. 84, 267-290 (2001).
  27. Bianco, P. R., Bradfield, J. J., Castanza, L. R., Donnelly, A. N. Rad54 oligomers translocate and cross-bridge double-stranded DNA to stimulate synapsis. Journal of Molecular Biology. 374 (3), 618-640 (2007).
  28. Pezza, R. J., Camerini-Otero, R. D., Bianco, P. R. Hop2-Mnd1 condenses DNA to stimulate the synapsis phase of DNA strand exchange. Biophysical Journal. 99 (11), 3763-3772 (2010).
  29. Rye, H. S., et al. Stable fluorescent complexes of double-stranded DNA with bis-intercalating asymmetric cyanine dyes: properties and applications. Nucleic Acids Research. 20 (11), 2803-2812 (1992).

Play Video

Citar este artículo
Bianco, P. R. Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies. J. Vis. Exp. (189), e64023, doi:10.3791/64023 (2022).

View Video