Summary

Verwendung von zwei optischen Pinzetten und Mikrofluidik für Einzelmolekülstudien

Published: November 18, 2022
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Summary

Die visuelle Einzelmolekülbiochemie, die durch mikrofluidische Kammern untersucht wird, wird durch Glaszylinder, gasdichte Spritzen, stabile Verbindungen von Schläuchen zu Durchflusszellen und Beseitigung von Blasen durch Platzierung von Schaltventilen zwischen Spritzen und Schläuchen erheblich erleichtert. Das Protokoll beschreibt duale optische Fallen, die die Visualisierung von DNA-Transaktionen und intermolekularen Interaktionen ermöglichen.

Abstract

Die visuelle Biochemie ist eine leistungsfähige Technik zur Beobachtung der stochastischen Eigenschaften einzelner Enzyme oder Enzymkomplexe, die in der Mittelung in Massenphasenstudien verdeckt werden. Um eine Visualisierung zu erreichen, werden zwei optische Pinzetten, bei denen eine Falle fest und die andere beweglich ist, in einen Kanal einer Multi-Stream-Mikrofluidikkammer fokussiert, die auf dem Tisch eines inversen Fluoreszenzmikroskops positioniert ist. Die optische Pinzette fängt einzelne Moleküle fluoreszenzmarkierter DNA ein und Flüssigkeit fließt durch die Kammer und vorbei an den gefangenen Perlen, dehnt die DNA in B-Form (unter minimaler Kraft, dh 0 pN), wobei die Nukleinsäure als weiße Schnur vor einem schwarzen Hintergrund beobachtet wird. DNA-Moleküle werden von einem Strom zum nächsten bewegt, indem die Stufe senkrecht zum Fluss übersetzt wird, um die Einleitung von Reaktionen auf kontrollierte Weise zu ermöglichen. Um erfolgreich zu sein, werden mikrofluidische Geräte mit optisch klaren Kanälen mit Glasspritzen verbunden, die in einer Spritzenpumpe gehalten werden. Optimale Ergebnisse sind fest mit der Durchflusszelle verbundene Steckverbinder, mechanisch steife und chemisch beständige Schläuche, die mit Schaltventilen verbunden sind, die Blasen eliminieren, die eine laminare Strömung verhindern.

Introduction

Die Fähigkeit, Protein-DNA-Interaktionen auf Einzelmolekülebene und in Echtzeit zu visualisieren, hat einen signifikanten Einblick in die Genomstabilität geliefert 1,2. Zusätzlich zur Arbeit mit einzelnen DNA-Molekülen bietet die Möglichkeit, Transaktionen zwischen einzelnen Molekülen in der Nähe anzuzeigen, zusätzliche Einblicke 3,4,5. Die Manipulation zusätzlicher DNA-Moleküle erfordert sowohl zusätzliche optische Fallen als auch hochwertige, mehrkanalige, mikrofluidische Flusszellen6.

Es gibt mehrere Methoden, um mehr als eine optische Falle zu erzeugen. Dazu gehören Galvanometer-Scanning-Spiegel, akustische optische Modulatoren und diffraktive Optiken, die holographische optische Pinzetten 4,7,8,9 erzeugen. Oft erzeugen scannende Spiegel und akustische optische Modulatoren Fallen, die Timesharing ermöglichen. In dem hier beschriebenen Aufbau wird der Strahl eines einzelnen Nd:YAG-Lasers auf Polarisation aufgeteilt, und dann steuern Galvanometer-Laserscanning-Spiegel die Position der sogenannten mobilen Falle (Abbildung 1)4. Um die Positionierung von Spiegeln und Filtern zu erleichtern, um den Einfangstrahl auf die hintere Öffnung des Mikroskopobjektivs zu lenken, wird ein HeNe-Laser verwendet. Dies erleichtert die Gesamtausrichtung, da der HeNe-Strahl mit bloßem Auge sichtbar ist, Infrarotstrahlen hingegen nicht. Der HeNe-Strahl ist auch sicherer zu arbeiten, wodurch die Positionierung von Spiegeln und anderen Komponenten weniger belastend wird. Zunächst ist der Strahlengang für diesen Laser vom 1064-nm-Strahl getrennt, wird aber in denselben Strahlengang und dann in das Mikroskopobjektiv eingeführt. Sobald die physikalische Ausrichtung erreicht ist, wird der 1064-nm-Strahl auf dem HeNe-Strahl positioniert, was durch die Verwendung eines Infrarot-Viewers und verschiedener Strahlbildgebungswerkzeuge zur Visualisierung der Strahlposition und -qualität erleichtert wird. Dann wird der Strahlexpander eingeführt und der resultierende erweiterte Infrarotstrahl wird auf die hintere Öffnung des Objektivs ausgerichtet. Schließlich wird das Objektiv entfernt und die Leistung in jedem polarisierten Strahl wird gemessen und unter Verwendung von λ/2-Wellenplatten so eingestellt, dass sie gleich ist (Abbildung 1C). Leistungsmessungen werden auch durchgeführt, sobald das Objektiv zurückgegeben wird, und in der Regel gibt es einen Leistungsverlust von 53%. Es ist jedoch genügend Energie vorhanden, um stabile feste und bewegliche optische Fallen in der Brennebene zu bilden (Abbildung 1D).

Für die Abbildung von DNA-Transaktionen spielen mikrofluidische Flusszellen eine Schlüsselrolle, da sie kontrollierte Messungen auf Einzelmolekülebene mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglichen (Abbildung 2). Der Begriff Mikrofluidik bezieht sich auf die Fähigkeit, Flüssigkeiten in einem oder mehreren Kanälen mit Abmessungen von 5-500 μm10,11 zu manipulieren. Der Begriff Strom bezieht sich auf die tatsächliche Flüssigkeit innerhalb eines Kanals und der Kanal bezieht sich auf den physikalischen Kanal, in dem sich ein oder mehrere Flüssigkeitsströme bewegen. Einkanal-Durchflusszellendesign hat einen gemeinsamen, physikalischen Kanal, in dem Reaktionen beobachtet werden und typischerweise nur ein Flüssigkeitsstrom vorhanden ist. Daher werden diese Designs als Single-Stream-Durchflusszellen bezeichnet. Im Gegensatz dazu sind Multi-Stream-Durchflusszellen als mikrofluidische Vorrichtung definiert, bei der zwei oder mehr Eintrittskanäle zu einem einzigen, gemeinsamen, physikalischen Kanal konvergieren (Abbildung 2A). Innerhalb des gemeinsamen Kanals fließen die aus den einzelnen Kanälen stammenden Flüssigkeitsströme parallel zueinander und bleiben getrennt, wobei aufgrund der Diffusion nur eine minimale Durchmischung zwischen ihnen auftritt (Abbildung 2B). In den meisten Versuchsaufbauten drückt eine einzige Pumpe Flüssigkeiten mit der gleichen Geschwindigkeit in jeden Kanal. Im Gegensatz dazu drücken bei der Grenzlenkung drei oder mehr unabhängig voneinander gesteuerte Pumpen Flüssigkeiten durch die Kanäle. Jede Pumpe arbeitet jedoch mit einer anderen Drehzahl, aber der Nettodurchfluss im gemeinsamen Kanal ist konstant12. Dies ermöglicht den schnellen Austausch von Hauptkanalkomponenten durch einfache Änderung der Pumpendrehzahl.

Neben der laminaren Strömung ist ein weiterer kritischer Faktor das parabolische Geschwindigkeitsprofil innerhalb des laminaren Strömungsstroms. Die höchste Strömungsgeschwindigkeit tritt in der Mitte des Stroms auf, die langsamste in der Nähe der Oberflächen (Abbildung 2C)13. Dieses Profil muss berücksichtigt werden, um ein DNA-Molekül, das an eine im Strom gehaltene Perle gebunden ist, vollständig zu dehnen, um fluoreszierende DNA präzise zu visualisieren und genaue Einzelmolekülanalysen durchzuführen. Hier wird die DNA zur B-Form gestreckt und unter 0 pN Kraft an Ort und Stelle gehalten. Um dies zu erreichen, sollte die Fokussierung der optischen Fallenposition auf eine Position 10-20 μm von der unteren Deckglasoberfläche erfolgen (Abbildung 2D). Es muss darauf geachtet werden, dass das DNA-Molekül nicht über die B-Form hinaus gestreckt wird, da dies Enzymreaktionen hemmen kann. Unter typischen Pufferbedingungen ist 1 μm = 3.000 bp DNA14. Darüber hinaus wird der DNA-Komplex durch das Einfangen von 10-20 μm vom Deckglas weit von der Oberfläche entfernt, wodurch Oberflächeninteraktionen minimiert werden.

Viele Methoden wurden verwendet, um mikrofluidische Gerätekanäle zu erzeugen, und diese können im Labor durchgeführt werden oder Durchflusszellen können aus kommerziellen Quellen gekauft werden 6,15,16,17. Die optimalen Materialien, die für die Konstruktion der Durchflusszellen verwendet werden, müssen mechanisch steif, optisch transparent mit geringer Fluoreszenz und undurchlässig für organische Lösungsmittel sein6. Häufig wird Borosilikat-Floatglas oder Quarzglas verwendet, um eine stabile Strömungsumgebung für eine längere Zeit bereitzustellen, die für optisches Einfangen, Visualisierung und Krafterkennung geeignet ist. Diese Materialien ermöglichen auch die Verwendung von nichtwässrigen Lösungsmitteln (z. B. spektrophotometrisches Methanol), um die Oberflächenbenetzung und Entfernung von Luftblasen zu vereinfachen, und Denaturierungsmitteln (z. B. 6M Guanidiniumhydrochlorid) oder Reinigungsmitteln zur Reinigung der Durchflusszelle. Schließlich variieren die Methoden zum Einbringen von Flüssigkeiten in Durchflusszellen von komplexen Vakuumpumpensystemen bis hin zu einzelnen Spritzenpumpen 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Bei dem hier beschriebenen Ansatz wird eine Spritzenpumpe verwendet, die bis zu 10 Spritzen aufnehmen kann (Abbildung 3A). Dies bietet Flexibilität für den Einsatz von einkanaligen Durchflusszellen oder Durchflusszellen mit mehreren Einlasskanälen. Hier wird eine dreikanalige Durchflusszelle verwendet, die mit Spritzen verbunden ist, die an der Spritzenpumpe mit Polyetherether-Keton-Schläuchen (PEEK) befestigt sind (Abbildung 3A-C). Der Durchfluss von Flüssigkeiten wird durch Vierwegeschaltventile gesteuert und dient somit dazu, das Einbringen von Blasen in die Durchflusszelle zu minimieren (Bild 3A,D). Darüber hinaus werden gasdichte Hamilton-Spritzen mit steifen Glaswänden und mit Polytetrafluorethylen (PTFE) beschichteten Kolben empfohlen, da sie eine außergewöhnlich gleichmäßige Kolbenbewegung bieten, die für einen reibungslosen Fluss unerlässlich ist14,27.

In dem beschriebenen Versuchssystem wurden Flusszellen mit zwei bis fünf Einlasskanälen eingesetzt. Die Anzahl der Einlasskanäle wird durch das durchgeführte Experiment bestimmt. Für die Untersuchung von RecBCD und Hop2-Mnd1 waren zwei Stromkanäle ausreichend14,28. Für die Helikase wurde das Enzym an das freie Ende der DNA gebunden und in einen Strom mit Magnesium und ATP übersetzt, um die Translokation und den Abbau einzuleiten. Für Hop2-Mnd1 wurde optisch eingeschlossene DNA in den angrenzenden Flüssigkeitsstrom übersetzt, der Proteine und Puffer ± zweiwertigen Metallionen enthält. Die Verwendung von Dreikanal-Flusszellen ermöglicht es, DNA in Strom 1 einzufangen, die DNA in Strom 2 zu übersetzen, um eine Proteinbindung zu ermöglichen, und dann in Strom 3, wo ATP vorhanden ist, um beispielsweise Reaktionen auszulösen. Eine Variation des oben Gesagten besteht darin, fluoreszierendes Protein in Kanal 2 zu verwenden, was dazu führt, dass der Flüssigkeitsstrom vollständig weiß ist und die Visualisierung der DNA ausschließt. Wenn dieses Molekül in Strom 3 übersetzt wird, sind nun sowohl Proteine als auch DNA sichtbar, wenn Reaktionen ausgelöst werden.

Die Verwendung von Vierwege-Schaltventilen zur Steuerung des Flüssigkeitsflusses ist eine kritische Komponente des Systems, um Blasen in den Durchflusszellen zu eliminieren. Blasen sind schädlich für eine stabile Flüssigkeitsströmung, da sie sich auf unvorhersehbare Weise zusammenziehen und ausdehnen, was zu schnellen Änderungen der Strömungsgeschwindigkeit und der Einführung von Turbulenzen führt. Wenn die Ventile zwischen Spritzen und Einlassschlauch positioniert sind, wird der Durchflusspfad durch Umschalten der Ventilposition beim Spritzenwechsel getrennt. Wenn die neue Spritze eingesetzt wird, kann der Kolben manuell gedrückt werden, so dass >6 μL (das Totvolumen des Ventils) ausgestoßen werden und Blasen fast vollständig eliminiert werden.

Die Befestigung von Steckverbindern an Durchflusszellen ist häufig der geschwindigkeitsbegrenzende Schritt bei der Verwendung von Durchflusszellen. Wir beschreiben die Verwendung von zwei Arten von Steckverbindern: abnehmbare sogenannte Press-Fit-Steckverbinder und permanente (Nanoport-Baugruppen). Die abnehmbaren Verbinder lassen sich einfach auf eine Durchflusszelle kleben und mit diesen Steckverbindern können neben dem empfohlenen PTFE auch verschiedene Arten von flexiblen Schläuchen getestet werden. Dies ist eine schnelle und kostengünstige Möglichkeit, Schläuche und Steckverbinder zu testen, ohne auf teurere Glasdurchflusszellen verzichten zu müssen. Im Gegensatz dazu sind Nanoport-Baugruppen dauerhaft angebracht, halten Drücken bis zu 1.000 psi stand und in unseren Händen ist ihre Verwendung auf PEEK-Schläuche unterschiedlicher Durchmesser beschränkt. Dies ist kein Nachteil, da vorzugsweise PEEK-Schläuche verwendet werden. Eine einzelne Glasdurchflusszelle mit festen Baugruppen kann bei sorgfältigem Gebrauch länger als 1 Jahr wiederverwendet werden.

Protocol

1. Laserfallenausrichtung und Prüfung mit Styroporperlen HINWEIS: Informationen zum Setup finden Sie in Abbildung 1A,B. ACHTUNG: Der Experimentator sollte während der Laserstrahlausrichtung eine geeignete Schutzbrille oder Laserschutzbrille tragen. Da das hierin beschriebene optische Pinzettensystem sowohl HeNe- als auch IR-Strahlen verwendet, sind zwei separate Sätze von Laserschutzgläsern erforderli…

Representative Results

Die erste Prüfung der Fallenausrichtung und -festigkeit erfolgt mit 1 μm, nicht fluoreszierenden Polystyrolperlen. Da der Großteil der im Labor durchgeführten Forschung Fluoreszenz verwendet, testen wir die Fallenstärke mit 1 μm, Dragon grünen Polystyrolperlen (Abbildung 1D, E). Danach wechseln die Arbeiten zum optischen Einfangen von DNA-Perlenkomplexen, bei denen die DNA mit dem bis-interkalierenden Farbstoff YOYO-114,29<sup class=…

Discussion

Die sorgfältige Montage des Strömungssystems ist entscheidend für das erfolgreiche Ergebnis der Experimente 4,6. Einer der schwierigsten Aspekte des Protokolls ist die Befestigung von Steckern an der Glasoberfläche. Dazu verwenden wir die folgenden zwei Ansätze: Einpressschlauchverbinder und Nanoport-Baugruppen. Einpressverbinder haften leicht auf Glas, gefolgt von PTFE-Schläuchen in die vorgeformten Löcher mit einer Pinzette. Wenn eine stabilere Befestigu…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Forschung im Bianco-Labor wird durch die NIH-Zuschüsse GM100156 und GM144414 an P.R.B. unterstützt.

Materials

100x objective Leica 506318 or 506038 Oil immersion lenses; Imaging and optical trapping only; Plan APO objectives optimized for fluorescence imaging
10X Objective Leica 506263 Used to locate laser beams spots during alignment; to find focus and X-Y position in flow cell
1 mm fluorescent beads Bangs Labs FSDG004 Used for tap performance, focal position determination
1 mm polystyrene beads Bangs Labs CPO1004 Used for trap performance evaluation and binding to biotinylated molecules
63x objective Leica 506081 Used to locate laser beams spots during alignment and to find focus and X-y position in flow cell; can be used for optical trapping as it has an identical back aperture diameter to the 100X; oil immersion lens
Alignment laser Lumentum 1100 series 10mW HeNe laser that is visible to the naked eye that is used to position optics
Beam alignment camera Amscope MU303 A simple, inexpensive and software controlled camera for imaging of the beam position
Camera control and Image capture software Hamamatsu HCImage Coordinates activities of the Lambda DG4 with the camera to facilitate rapid wavelength switching
Camera; Orca flash 4 Hamamatsu c13440-20cu CCD camera for imaging of single-molecule experiments
C-mount for the beam alignment camera Spot imaging solutions DE50CMT Provides optimal positioning of the camera for imaging of laser beams during alignment
C-mount for the Orca Flash 4 camera Has a retainer ring to hold an IR blocking filter in place. This eliminates reflected IR beam from the optical traps and facilitates clearer imaging of trapped objects.
Cy5  fluorescence filter cube Semrock cy5-404a-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image Cy5 only
Fitc-Txred  fluorescence filter cube Semrock fitc/txred-2x-b-000 Used in conjunction with Lambda DG4 to image FITC and TXRed
Fluidics tubing Grace Bio 46004 PTFE tubing as an alternate to PEEK; works well on some flow cells. Can be used with PDMS flow cells or glass flow cells when Grace Bio fit tubing connectors are used
GFP fluorescence filter cube Semrock gfp-3035b-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image GFP only
Glass flow cells Translume Custom Clear flow channels for imaging (Fig. 2E)
Glass glue Loctite 233841 Securely and easily bonds Nanoport assemblies to glass flow cells
Glass/PDMS sandwich flow cells CIDRA Precision services Custom design Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Fig. 2C)
Hamilton Cleaning solution Hamilton 18311 Gentle but efficient cleaning solution for glass flow cells; does not bubble when used carefully
Illumination system Sutter Instrument Lamda DG4 Discontinued so recommend Lambda 721
Illumination system Sutter Instrument Lamda DG4 Discontinued so recommend Lambda 721
Image analysis software Media cybernetics Image Pro Premiere Analysis of images and single molecule tracking
Image analysis software Fiji/NIH Image/Image J Shareware Analysis of images and single molecule tracking
Image display card Melles Griot 06 DLA 001 Alternate product from Thorlabs: VRC5
Immersion oil Zeiss 444960 Immersol 518 F fluorescence free
Laser beam alignment tools Thor labs FMP05/M; dgo5-1500-h1; BHM1  Used to ensure beams are horizontal and at the correct height
Laser beam viewer Canadian Photonics labs IR 3150 Used to image IR beam spots on mirrors and  targets
Laser power meter Thor labs Measurement of laser output as well as trap strength
Laser safety glasses (HeNe) Thor labs LG7 or 8 Blocks >3 OD units of light of wavelengths >600 nm
Laser safety glasses (IR) Thor labs LG11 Blocks >7 OD units of light of wavelengths ³1000 nm
Mcherry  fluorescence filter cube Semrock mcherry-a-lsc-zero Used in conjunction with Lambda DG4 to image mcherry only
Microscope Leica DMIRE2 DIC port removed to accommodate Dichroic trapping/alignment mirror
Microscope control software  UCSF/shareware uManager Controls the microscope, permits focal alignment of objectives as well as stage control
Nanoport assembly IDEX N333 Connectors that are bonded to flow cells
Optical table support Thor Labs PA52502 Active isolation table support
Optics and lenses Solar TII Various Interference mirrors, telescopes and lenses custom designed for the system
PDMS flow cells ufluidix Custom Flow cells built according to your specifications; imaging channels are clear (Figs. 2B and D)
PEEK tubing IDEX 1532 Provides excellent connection to flow cells and switching valves
Pinkel fluorescence filter cube Semrock lf488/543/635-3x-a-000 Used in conjunction with Lambda DG4 to image multiple fluorophores rapidly
Press fit tubing connectors GraceBio 46003 Clear silicone connector with adhesive that binds well to glass
Scanning mirrors GSI Lumonics VM500 Used to provide control of the second optical trap. GSI Lumonics no longer exists. Similar mirrors can be purchased from Cambridge Scientific
Stage Leica
Stage micrometer Electron Microscopy Sciences 68042-08 Provides on screen ruler for positioning of the beam and system calibration
Switching valves IDEX V-101T Control direction of fluid flow and eliminate introduction of bubbles into flow cells
Syringe and valve manifold Machine shop None Custom built
Syringe pump Harvard Apparatus PHD 2000 Controls fluid flow through flow cells
Syringe pump software Harvard Apparatus 70-6000 Flow control provides seamless, programmable control of fluid flow
Syringes Hamilton 81320 Gas-tight, PTFE Luer Lock, glass barrels with Teflon-coated plungers
Table top Thor Labs T36H Optical table top or breadboard
Trapping laser Newport/Spectra Physics J-series; BL106C Nd:YAG laser; 1064 nm; 5W laser

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Bianco, P. R. Use of Dual Optical Tweezers and Microfluidics for Single-Molecule Studies. J. Vis. Exp. (189), e64023, doi:10.3791/64023 (2022).

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