Experimentell virusinfektion hos vuxna myggor genom oral utfodring och mikroinjektion
Summary
Denna metod, som inkluderade oral utfodring och intratorakal injektionsinfektion, kunde effektivt bedöma påverkan av midgut och / eller spottkörtelbarriärer på arbovirusinfektion.
Abstract
Myggburna virus (MBV), som är infektiösa patogener för ryggradsdjur, sprids av många myggarter och utgör ett allvarligt hot mot folkhälsan. När de väl har intagits måste virusen övervinna myggmidgutbarriären för att nå hemolymfen, varifrån de potentiellt kan spridas till spottkörtlarna. När en mygga biter sprids dessa virus till nya ryggradsdjurvärdar. På samma sätt kan myggan plocka upp olika virus. I allmänhet kan endast en liten del av virus komma in i spottkörtlarna via tarmen. Överföringseffektiviteten hos dessa virus till körtlarna påverkas av de två fysiska barriärerna som finns i olika myggarter: midgutbarriärer och spottkörtlar barriärer. Detta protokoll presenterar en metod för virusdetektion i spottkörtlar av Aedes aegyptis efter oral utfodring och intratorakal injektionsinfektion. Dessutom kan bestämning av om tarmarna och / eller spottkörtlarna hindrar viral spridning hjälpa till vid riskbedömningar av MBV som överförs av Aedes aegypti.
Introduction
Myggburna virus (MBV), en heterogen grupp av RNA-virus, kan kvarstå i myggvektorer och därefter spridas till ryggradsdjurvärdar 1. De kliniskt viktiga MBV:erna är huvudsakligen fördelade i fyra virusfamiljer, nämligen Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae och Peribunyavividae 2,3. Under de senaste decennierna har dessa virus rapporterats över hela världen och orsakat folkhälsoproblem. Som en av de mest kända MBV: erna har Dengue-virus (DENV) blivit det vanligaste framväxande eller återuppväxande arboviruset i över 100 länder under de senaste 20 åren4. Sedan upptäckten av Zika-virus (ZIKV) inåt landet har nästan alla tropiska och subtropiska länder och territorier på kontinenten rapporterat humana ZIKV-infektioner5. För att bedöma risken för virusöverföring har många studier de senaste åren fokuserat på myggvektorkompetens för dessa virus 6,7. Som ett resultat är det viktigt att effektivt förebygga och kontrollera vektorburna sjukdomar.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), en av de lättast uppfödda myggorna i laboratoriet, är en viktig vektor av DENV, ZIKV, Chikungunya-virus (CHIKV) och gulfebervirus (YFV)8. Under lång tid hittades Ae. aegypti enbart på den afrikanska kontinenten och i Sydostasien, men de senaste åren har den koloniserat nästan alla kontinenter9. Dessutom har det globala överflödet av Ae. aegypti ökat kontinuerligt, med en uppskattad ökning med 20% i slutet av seklet10. Från 2004 till 2009 i Kina fanns det en tydlig ökning av Ae. aegypti vektorkompetens för DENV på grund av högre dagliga temperaturer11. Statusen för Ae. aegypti som den patogena vektorn har ökat avsevärt i Kina. För att ta itu med dessa utmaningar är det därför nödvändigt att undersöka vektorkompetensen hos Ae. aegypti att överföra virus.
Som en hematofagisk leddjur genomtränger den kvinnliga myggan huden hos en ryggradsdjur värd och matar på blodet. Myggor förvärvar ibland virus från virusinfekterade värdar och överför sedan virusen till en ny värd. Som sådan, för att bestämma vektorkompetens, matas myggor ett konstgjort blodmjöl innehållande arbovirus genom ett matningssystem i laboratorieinställningen12. Enskilda myggor separeras i huvuden, kroppar och salivsekretioner flera dagar efter infektion. För att mäta virusinfektion, spridning och överföringshastigheter har virustitrar detekterats genom kvantitativ omvänd transkription PCR (qRT-PCR) eller plackanalys. Men inte alla myggor utvecklar midgutinfektioner och förmågan att överföra ett virus till nästa värd efter blodmatning. Det är kopplat till myggans fysiologiska barriärer, som hindrar patogener från att tränga in i kroppen och spelar en viktig roll i deras medfödda immunitet13. Midgutbarriärerna, särskilt midgut infection barrier (MIB) och midgut escape barrier (MEB), påverkar om viruset kan infektera vektorn systemiskt och effektiviteten med vilken den sprids. Det hindrar analysen av andra vävnaders infektion, såsom spottkörtlar som också uppvisar spottkörtelinfektion och undgår hinder13,14. För att bättre karakterisera infektionen av midguts och spottkörtlar i vektorn, presenteras ett detaljerat protokoll för oral utfodring och intratorakal inokulering av arbovirus i Ae. aegypti häri. Detta protokoll kan tillämpas på ytterligare arbovirusinfektioner i en mängd olika myggvektorer, såsom DENV- och ZIKV-infektion i Aedes spp., och kan visa sig vara ett praktiskt förfarande.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med denna metod var att tillhandahålla en omfattande riskbedömning av ett myggburet virus genom att utvärdera vektorkompetens genom oral utfodring och intratorakal inokulering.
I det orala utfodringsexperimentet måste engorged-myggor plockas ut och överföras till en ny behållare, vilket utgör en allvarlig risk för operatörerna. Anledningen till detta är att någon mygga, inklusive oinfekterade myggor, kan vara en källa till infektion19. Följaktligen …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501).
Materials
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
Referencias
- Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle. Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).
- Sukhralia, S., et al. From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).
- Kuhn, J. H., et al. Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales. Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).
- Wei, Y., et al. Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).
- Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity. Pathogens. 9 (10), (2020).
- Naslund, J., et al. Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).
- Lwande, O. W., et al. Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).
- Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios. Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).
- Cai, W., et al. The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity. Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).
- Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses. Parasites & Vectors. 13 (1), 188 (2020).
- Kumar, A., et al. Mosquito Innate Immunity. Insects. 9 (3), (2018).
- Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes. Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).
- Xia, H., et al. Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border. Frontiers in Microbiology. 10, (2020).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).
- Yang, C., et al. Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus. bioRxiv. , (2022).
- Britton, S., et al. Laboratory-acquired dengue virus infection–a case report. PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).
- Elizondo-Quiroga, D., et al. Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus. Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).
