Экстракция и очистка белка FAHD1 из печени свиной почки и мыши
Summary
Этот протокол описывает, как извлечь фумарилацетоацетат гидролазу, содержащий домен белка 1 (FAHD1), из почек свиней и печени мыши. Перечисленные способы могут быть адаптированы к другим белкам, представляющим интерес, и модифицированы для других тканей.
Abstract
Фумарилацетоацетат гидролаза, содержащий домен белка 1 (FAHD1), является первым идентифицированным членом надсемейства FAH у эукариот, действующим как оксалоацетатдекарбоксилаза в митохондриях. В данной статье представлен ряд методов экстракции и очистки FAHD1 из почек свиней и печени мышей. Охватываемыми методами являются ионообменная хроматография с быстрой белковой жидкостной хроматографией (FPLC), препаративная и аналитическая гелевая фильтрация с FPLC и протеомные подходы. После полной экстракции белка были исследованы осаждение сульфата аммония и хроматография ионного обмена, а FAHD1 экстрагировали с помощью последовательной стратегии с использованием ионного обмена и размерно-эксклюзионной хроматографии. Этот репрезентативный подход может быть адаптирован к другим белкам, представляющим интерес (выраженным на значительных уровнях) и модифицирован для других тканей. Очищенный белок из ткани может поддерживать выработку высококачественных антител и/или мощных и специфических фармакологических ингибиторов.
Introduction
Эукариотический домен FAH-содержащий белок 1 (FAHD1) действует как бифункциональная оксалоацетат (OAA), декарбоксилаза (ODx)1 и ацилпируватгидролаза (ApH)2. Он локализован в митохондриях2 и принадлежит к широкому надсемейству ферментовFAH 1,2,3,4,5,6. В то время как его активность ApH имеет лишь незначительное значение, активность ODx FAHD1 участвует в регулировании потока цикла TCA 1,7,8,9. OAA не только необходим для реакции центральной цитратсинтазы в цикле трикарбоновой кислоты, но также действует как конкурентный ингибитор сукцинатдегидрогеназы как часть системы переноса электронов и как катаплеротический метаболит. Снижение регуляции экспрессии гена FAHD1 в эндотелиальных клетках пупочных вен человека (HUVEC) привело к значительному снижению скорости пролиферации клеток10 и значительному ингибированию потенциала митохондриальной мембраны, связанного с сопутствующим переходом на гликолиз. Рабочая модель относится к митохондриальной дисфункции, связанной со старением (MiDAS)11-подобным фенотипом8, где уровни митохондриального OAA жестко регулируются активностью FAHD1 1,8,9.
Рекомбинантный белок легче получить путем экспрессии и очистки от бактерий12 , а не от ткани. Однако белок, экспрессируемый в бактериях, может быть смещен из-за возможного отсутствия посттрансляционных модификаций или может быть просто проблематичным (т. Е. Из-за потери плазмид, реакций бактериального стресса, искаженных / несформированных дисульфидных связей, отсутствия или плохой секреции, агрегации белка, протеолитического расщепления и т. Д.). Для определенных применений белок должен быть получен из клеточного лизата или ткани, чтобы включить такие модификации и/или исключить возможные артефакты. Очищенный белок из ткани поддерживает выработку высококачественных антител и/или мощных и специфических фармакологических ингибиторов для выбранных ферментов, таких как FAHD113.
В данной рукописи представлен ряд методов извлечения и очистки FAHD1 из печени свиной почки и мыши. Описанные методы требуют быстрой белковой жидкостной хроматографии (ФПЛК), но в остальном используют общее лабораторное оборудование. Альтернативные методы можно найти в других местах 14,15,16,17. После полной экстракции белка предлагаемый протокол включает в себя фазу тестирования, на которой обсуждаются подпротоколы для осаждения сульфата аммония и хроматографии ионного обмена (рисунок 1). После определения этих подпротоколов интересующий белок извлекается с помощью последовательной стратегии с использованием ионного обмена и размерно-эксклюзионной хроматографии с FPLC. Основываясь на этих руководящих принципах, окончательный протокол может быть адаптирован индивидуально для других белков, представляющих интерес.
Рисунок 1: Общая стратегия этого протокола. Сверху донизу: Белок извлекается из тканей. Тканевый гомогенат готовят, центрифугируют и фильтруют. Для каждой пары образцов, полученных из супернатанта и гранул, необходимо провести испытания на осаждение сульфата аммония и ионно-обменную хроматографию (FPLC) для определения оптимальных условий. После установления этих подпротоколов белок может быть извлечен с помощью последовательной процедуры осаждения сульфата аммония, хроматографии ионнообменной хроматографии и повторяющейся хроматографии с исключением размера (FPLC) при различных концентрациях рН и солей. Все шаги должны контролироваться западным пятном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги в протоколе
Соблюдение общих рекомендаций по обращению с белками имеет важное значение, например, работа на льду и в умеренных условиях pH и соли. Применение ингибиторов протеазы выгодно для метода, в то время как использование ингибиторов протеасом настояте…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы очень благодарны за техническую помощь Айсе Озтюрк и Еве Альбертини. Мыши, используемые для генерации ткани печени, содержались под наблюдением Univ.-Doz. Д-р Пиддер Янсен-Дюрр (Институт биомедицинских исследований старения при Инсбрукском университете, Реннвег 10, 6020 Инсбрук, Австрия).
Materials
| 0.22 µm filter units | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, not steril |
| 0.45 µm filter units | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, not steril |
| 15 mL Falcon tubes | VWR | 734-0451 | centrifugal tubes |
| 50 mL Falcon tubes | VWR | 734-0448 | centrifugal tubes |
| 96-Well UV Microplate | Thermo-Fischer | 8404 | UV/VIS transparent flat-bottom 96 well plates |
| Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) | BIO-RAD | #1610147 | 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3.3% crosslinker) solution for casting polyacrylamide gels |
| ÄKTA FPLC system | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | – | using the FPLC system by GE Healthcare; different custom versions exist; this work used the "ÄKTA pure" system |
| Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC901024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 15 mL |
| Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC801024 | centrifigal filters for protein enrichment; 10 kDa molecular mass filter; 4 mL |
| Ammonium sulfate powder | MERCK | A4418 | ammonium sulphate for molecular biology, ≥99.0% |
| Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% | MERCK | 215589 | Catalyst for acrylamide gel polymerization. |
| Coomassie Brilliant blue R 250 | MERCK | 1125530025 | Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) for electrophoresis Trademark of Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6.2 (10 g/l, H2O, 25 °C) |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MERCK | D9277 | Cellulose membranes for the exchange of buffers via dialysis. |
| Eppendof tubes 1.5 mL | VWR | 525-1042 | microcentrifugal tubes; autoclaved |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 28989334 | HiLoad Superdex 75 pg prepacked columns are for high-resolution size exclusion chromatography of recombinant proteins |
| Immun-Blot PVDF Membrane | BIO-RAD | #1620177 | PVDF membranes are protein blotting membranes optimized for fluorescent and multiplex fluorescent applications. |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | #1703930 | Use the Mini Trans-Blot Cell for rapid blotting of Mini-PROTEAN precast and handcast gels. |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BIO-RAD | #1658004 | 4-gel vertical electrophoresis system, includes electrode assembly, companion running module, tank, lid with power cables, mini cell buffer dam. |
| Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516701 | Mono Q columns are strong anion exchange chromatography columns for protein analysis or small scale, high resolution polishing of proteins. |
| Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516901 | Mono S columns are strong cation exchange chromatography columns for protein analysis or small scale high resolution polishing of proteins. |
| PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | A mixture of 10 blue-, orange-, and green-stained proteins (10 to 180 kDa) for use as size standards in protein electrophoresis (SDS-PAGE) and western blotting. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo-Fischer | 23225 | A two-component, high-precision, detergent-compatible protein assay for determination of protein concentration. |
| Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter | Branson | – | New models at https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf |
| Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) | Agilent Dako | P0399 | The antibody used for horseradish peroxidase conjugation reacts with rabbit immunoglobulins of all classes. |
| TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA | MERCK | T9281 | TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine) is molecule which allows rapid polymerization of polyacrylamide gels. |
| Tube Roller | – | – | A general tube rotator roller; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71 |
| Tube Rotator | – | – | A general tube rotator wheel; e.g. a new model at https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123 |
| ULTRA-TURRAX; T 25 digital | IKA | 0003725000 | New models at https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/ |
Referencias
- Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).
- Pircher, H., et al. Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase. Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).
- Kang, T. -. W., et al. Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development. Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).
- Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -. J. Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies. Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).
- Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase. Structure. 7 (9), 1023-1033 (1999).
- Bateman, R. L., et al. Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor. Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).
- Weiss, A. K. H., et al. Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1. Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).
- Etemad, S., et al. Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 – a new regulator of mitochondrial function and senescence. Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).
- Weiss, A. K. H., et al. Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily – A role in calcium homeostasis. Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284 (2020).
- Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells. Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).
- Wiley, C. D., et al. Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype. Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).
- Weiss, A. K. H., et al. Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729 (2019).
- Weiss, A. K. H., et al. Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1). Molcules. 26 (16), 5009 (2021).
- Mizutani, H., Kunishima, N. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8. Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).
- Lee, C. H. A simple outline of methods for protein isolation and purification. Endocrinology and Metabolism. 32 (1), 18-22 (2017).
- Amer, H. E. A. Purification of proteins: Between meaning and different methods). Proteomics Technologies and Applications. , (2019).
- Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes. Frontiers in Plant Science. 9, 802 (2018).
- Gordon, J. A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).
- Gallagher, S. R. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).
- . Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography Available from: https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf (2011)
- Sørensen, B. K., et al. Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).
- Fagerberg, L., et al. Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).
- . Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography Available from: https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography (2022)
- Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges. Frontiers in Microbiology. 5, 172 (2014).
- Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update. Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).
